试剂、试剂盒 醋酸无水乙醇硫酸二甲酯DMSDMS 缓冲液DMS 终止液EDTA 甲酰胺甲酰胺上样缓冲液肼 肼终止液NaClNaOH-EDTA 溶液哌啶水溶液哌啶甲酸乙酸钠聚丙烯酰胺测序凝胶鲑鱼精 DNA放射标记的目标 DNA 酵母 tRNA

仪器、耗材 干冰-乙醇浴切仑科夫（Cerenkov) 记数器冰水浴 小离心管 旋转真空干燥器有紧固盖的循环水浴装置凝胶测序装置及电源可调 37°C 和 90°C 的水浴装置

实验步骤

材料

溶液和缓冲液

贮存液、缓冲液和试剂的配方请参照附录 1。

醋酸（1mol/L): 用冰醋酸（17.4mol/L) 现配

无水乙醇：-20°C

硫酸二甲酯（DMS): 浓度 99%(Aldrich; 金色标签 99%)

DMS(10%V/V) 溶于乙醇中

DMS 缓冲液

50 mmol/L 二甲基砷酸钠（pH7.0)

1 mmol/I.EDTA(pH8.0)

警告：称量二甲基砷酸钠时使用手套和面具，使用 DMS 缓冲液时使用手套。

DMS 终止液

1.5mol/L 乙酸钠（pH7.0)

1mol/Lβ-巯基乙醇

250ug/ml 酵母 tRNA

EDTA(0.5mol/L,pH8.0)

甲酰胺

甲酰胺上样缓冲液

肼（95%)

肼（EastmanKodak), 分装成小份，置于紧密封口的微量离心管中，保存干-20°C。

肼终止液

0.3mol/L 乙酸钠（pH7.0)

0.1 mmol/LEDTA(pH8.0)

100ug/ml 酵母 tRNA

NaCl(5mol/L)

NaOH-EDTA 溶液：1.2mol/LNaOH 含 1 mmol/LEDTA

1mol/L 哌啶水溶液

应新鲜配制，在刻度玻璃管中用 1 倍体积哌啶（10mol/L;Fisher) 混合 9 倍体积水。

1mol/L 哌啶甲酸

用 10mol/L 哌啶将 4% 甲酸水溶液调至 pH2.0 即可，

3mol/L 乙酸钠（pH5.2)

胶

聚丙烯酰胺测序凝胶

Maxam-Gilben 测序反应产物通常在 6% 或者 8% 的变性聚丙烯酰胺凝胶上分析（请参考方案 8)。

梭酸和寡梭苷酸

鲑鱼精 DNA(lmg/ml) 水溶液

修剪的鲑鱼精 DNA 通常被用来作为化学测序的载体。事实上，几乎所有 DNA 都可以。而修剪的鲑鱼精 DNA 可以作为商品买到，同时也可以在实验室中得到（见第 6 章，方案 10)

放射标记的目标 DNA

标记的片段必须包括最少 5x105Ci/min 的 32P, 溶于水中可至 5000Ci/min/ul(细节请见补充方法：制备化学测序中的末端标记 DNA)。DNA 溶液必須无盐。如果放射性标记的 DNA 有限. 有时可以只进行 5 反应流程中的 4 个（C、C+T,A+G、G) 就得到序列结果。

酵母 tRNA(1 mg/ml 水溶液）

特殊装置

干冰-乙醇浴

切仑科夫（Cerenkov) 记数器（见附录 8)

冰水浴

小离心管

切割反应通常在标准 1.5 ml 小离心管中进行。当同时进行不同实验时，可用不同颜色的管以区分。有些研究者使用硅处理过的管。其实这一措施并不必要，只需在每步沉淀后都将 DNA 彻底溶解即可。例如，可用 Tip 头吸取缓冲液彻底冲洗管壁，或延长涡旋振荡的时间。

旋转真空干燥器

如 SavantSpeedVac。

有紧固盖的循环水浴装置

例如 ResearchProductsInternational 产品。

选用，见第 4 步。

凝胶测序装置及电源

参见方案 11。

可调 37°C 和 90°C 的水浴装置

方法

1. 准备好放射性标记的DNA, 依表12-16的流程图操作。

通常只进行流程中的4个反应（C,C+T,A+G,G)就可得到序列结果。

2. 在以上4或5个包含修饰碱基的冻干的DNA样品中加入100ul 1mol/L哌啶，用涡旋振荡器重悬。

哌啶用来切断DNA链上化学修饰位点的糖-磷酸键。

3. 盖严管口，用涡旋振荡器混匀。如果需要，稍离心（2000r/min)使混合物聚集于管底。

4.90°C孵育30 min。为防止管盖弹开，可以在管上压上重物，或用塑料胶带封住管口, 或在有紧固盖的循环水浴装置中反应。

5. 等管冷却到室温，打开盖子，用石蜡膜（Parafilm)封上打开的管子，用21号针头在石蜡膜上刺几个孔。在旋转真空干燥机上将其抽干。

为避免最后的测序胶上条带模糊不清，必须彻底去除碱基持异切割反应中的哌啶。最好在冻干的情况下使用旋转真空干燥机。依抽干机效率而言，此步常需要1~4小时。一些研究者倾向于在抽干前用干冰-乙醇溶冷冻样品。

6. 取出小管。去除石蜡膜并加入20ul水。盖上管盖，涡旋振荡30s溶解DNA。稍离心使溶液聚集在管底。使用手持微型计数器计数以确认管壁上的标记DNA已经完全被溶解在了水溶液中。

7. 重复一次，在旋转真空干燥机上将其抽干，这一步依抽干机效率常需要15~30 min。

(参照第5步）。

8. 重复步骤6和7。

为了确保哌啶被完全除去. 一些研究者倾向于再次将DNA溶于10ul水并抽干。可是, 一般而言，只有在样品呈油状或者需要很长的抽干时间时才需要进行这一步。

9. 用切仑科夫（Cerenkov)记数器估计管中的放射活性，把修饰并切割后的反应物于测序胶缓冲液中。在柯达XAR-5胶片上的过夜曝光时，在一个碱基之后的切割反应物需要大约25000cpm(C和G 反应），在两个碱基之后的切割反应物需要大约50000cpm(C+T，A+G,A>G)。所以，溶解在测序缓冲液中的C和G反应物要达到25000cpm/3ul; 而C+T,A+G和A>G反应物要达到 50000cpm/3ul。涡旋混合物使 DNA 完全溶解，稍离心使混合物聚集于管底。样品可在-20°C 保存数小时。

10. 在 90°C 加热 lmin 使 DNA 变性，在冰上骤冷。用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析结果（参见方案 8，9,10,11 和 12)。