DNA定点突变实验

实验方法原理 
定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱基的添加、删除、点突变等。

单点突变的原理是从常规E.coli中经纯化试剂盒(Miniprep)或者氯化铯纯化抽提得到质粒。设计一对包含突变位点的引物（正、反向），和模版质粒退火后用PfuTurbo聚合酶“循环延伸”，(所谓的循环延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物5’端终止，再经过反复加热褪火延伸的循环，这个反应区别于滚环扩增，不会形成多个串联拷贝。)正反向引物的延伸产物退火后配对成为带缺刻的开环质粒。DpnI酶切延伸产物，由于原来的模版质粒来源于常规大肠杆菌，是经dam甲基化修饰的，对DpnI敏感而被切碎（DpnI识别序列为甲基化的GATC，GATC在几乎各种质粒中都会出现，而且不止一次），而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开，因此在随后的转化中得以成功转化，即可得到突变质粒的克隆。

多点突变的原理是准备多个带突变的引物（同方向，对同一单链模版），退火后全部突变引物（不超过5个）都结合在同一环状单链模版，PfuTurbo聚合酶延伸，碰到下一个引物就停止，各片断经连接成环，和单链模版组成杂和环，Dpn I消化双链模版，也消化杂和环中的模版，只留下新合成的带多个突变的单链环（mutant ssDNA），得以转化E.coli，形成双链质粒。资料表明，引入3个定点突变的效率为60%，5个定点突变的效率为30%。得到的其他质粒是带有较少定点突变的质粒，以引入3个定点突变为例，就是有40% 左右的转化质粒是带有1-2个不同定点突变的质粒（因为存在1-2个引物结合模版延伸形成单链环的可能）。
 
实验材料 DNA
试剂、试剂盒 pyrobest DNA聚合酶DpnI去离子水BSA大肠杆菌DH5a菌株
仪器、耗材 PCR仪离心管移液枪枪头枪头盒水浴锅灭菌锅培养箱
实验步骤 
一、引物设计

每条引物都要携带有所需的突变位点，引物一般长25~45 bp，设计的突变位点需位于引物中部。
 
二、反应

1.  使用高保真的pyrobest DNA聚合酶，循环次数少，一般为12个循环。
 
2.  反应体系：
 
（1）10x pyrobest Buffer： 5 ul
 
（2）dNTP Mixture(10 mM) ：1 ul
 
（3）模板DNA(5~50 ng) ：1ul
 
（4）primer 1 (125 ng) ：1 ul
 
（5）primer 2 (125 ng) ：1 ul
 
（6）pyrobest DNA polymerase（TaKaRa）(5 U/ul)：0.25 ul
 
（7）加无菌蒸馏水至50ul.
 
三、产物沉淀纯化

1.  加1/10 体积的醋酸钠，1倍体积的异丙醇，混匀置冰上（或-20℃冰箱）5min，离心弃上清。

2.  70~75%乙醇洗盐两次，烘干后溶于无菌水中（此步可省略，直接用 DpnI酶切）。
 
四、DpnI酶切

1.  酶切体系

（1）Buffer ：2 ul
 
（2）BSA（100╳）：0.2 ul
 
（3）DNA ：x ul
 
（4）DpnI：0.5 ul
 
（5）加无菌去离子水至 20 ul。
 
2.  30℃酶切 1~4 h。

3.  65℃水浴15min 终止反应。
 
五、转化

将酶切产物转化大肠杆菌DH5a菌株，利用抗生素筛选突变子。
 
六、测序验证
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注意事项 
1.  引物和质粒都准备好后，当然就是做PCR喽，不过对于PCR的酶和buffer，不能用平时的，我们做PCR把整个质粒扩出来，延伸长度达到几个K，所以要用那些GC buffer或扩增长片段的buffer，另外，要用保真性能较好的PFU酶来扩增，防止引进新的突变。
 
2.  Quick change试剂盒分为几种不同的类型，QuikChange&reg、Site-Directed Mutagenesis Kit标准点突变试剂盒 、QuikChange&reg、 XL Site-Directed Mutagenesis Kit长模板单点突变试剂盒（>8kb）从原理上是一样的，只是PCR的酶和BUFFER不一样，后面用了比较适合长片段扩增的酶和BUFFER罢了，没什么特别的东西。
 
3.  DpnI处理的时间最好长一点，最少一个小时吧，最好能有两三个小时，因为如果模板处理得不干净，哪怕只有那么一点点，模板直接在平板上长出来，就会导致实验失败。
 
4.  实验板长出来的菌有两种可能，一种是质粒DPNI没处理干净长出来的（模板），一种是PCR产物转化出来的（突变体），不过这两种菌长得一模一样，即使提出质粒来也是一样（酶切和PCR都无法区分），除了测序，是分不出来的。

5.  做PCR时也最好做一个负对照（不加引物），实验管由于PCR时有引物，所以在DNPI处理前里面既含有模板又含有PCR产物，而对照管由于PCR时没放引物，所以在DPNI处理前里面只有模板。如果两者都拿去DNPI处理，就能够证明模板已经被去除干净。若实验顺利的话应该是：正对照长菌负对照不长菌。如果出现正负对照都长菌，那么就是DpnI没处理好，如果正负对照都不长菌，那么有两种可能，一种是PCR阴性，也就是说PCR出问题了，另外一个可能就是转化出问题了。要搞清楚是哪个问题，跑胶说明不了问题，那就做个转化的对照，拿试剂盒的对照实验去试感受态，马上就能知道转化有没问题。

其他 
一、经验分享

1.  实验的目的应该比较明确吧：就是要把自己的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。一般情况下我们会有几种可能使我们需要这样去做：
 
第一：我们吊出来的基因有点突变，相信这可能是大家经常会遇到的问题。基因好不容易吊出来，并装进了自己的载体，却发现有一两个碱基跟自己的预期序列或所有的公共数据库不匹配，然后暴昏。