实验方法原理 dNTP ，PCR 缓冲液，聚合酶混合液，嵌套引物，LB-氨苄液体培养基，溶液NaOH，SSC，Tris-HCl，PCR 产物

微量滴定板，尼龙膜，紫外交联装置，96 孔或 384 孔复制器，热循环仪，PCR 管或反应板

试剂、试剂盒 dNTP PCR 缓冲液聚合酶混合液嵌套引物LB-氨苄液体培养基溶液NaOHSSCTris-HClPCR 产物

仪器、耗材 微量滴定板尼龙膜紫外交联装置96 孔或 384 孔复制器热循环仪PCR 管或反应板

实验步骤

第 1 阶段：通过 PCR 扩增 DNA 插入片段

一、材料

1. 缓冲液、溶液和试剂

dNTP 溶液（包含所有 4 种 dNTP, 每种为 10 mmol/L)

2. 酶和酶缓冲液

10XPCR 缓冲液（40 mmol/LTricine-KOH、22°C 下 pH9.2,3.5 mmol/L 乙酸镁,10 mmol/L 乙酸钾，75 mg/mlBSA, 或者厂商提供）

聚合酶混合液，50X(Advantage2，Clontech，或相当产品）

3. 核酸和寡核苷酸

嵌套引物 NP1*

嵌套引物 NP2R*

*或者，载体上插入位点两侧的引物也可以用来进行 PCR 扩增插入片段。

4. 培养基

LB-氨苄液体培养基

配制 1L 培养基，在 950 ml 无离子水中溶解 10 g 细菌用胰蛋白胨、5 g 细菌用酵母提取物、10 gNaCl,用 5mol/LNaOH 调节 pH 到 7.0。用无离子水将体积补到 1L。在 151bf/in2(llbf/in2=6894.76Pa)下高压灭菌 20 min。髙压灭菌后的培养基冷却后，加入氨苄西林，使终浓度为 50ug/ml。

5. 专用设备

热循环仪

在这一阶段，PCR 在板子上进行，而且不得要以前的精确度，因而没有必要使用矿物油。

PCR 管或反应板

6. 附加试剂

琼脂糖凝胶电泳所需的试剂与设备

7. 细胞和组织

cDNA 文库，存在于合适的菌株中，以菌落的形式生长在 LB 琼脂平板上

二、方法

1. 从文库中随机挑取 96 个或 384 个白色的细菌菌落。

2. 在一个 PCR 板上，每个菌落用 150ulLB-氨苄培养基 37°C 下轻轻振荡培养，时间至少为 4 h(或过夜）。

3. 配制用于 100 个或 400 个 PCR 的主体混合液。

4. 将 19ul 主体混合液分装到每个管子或反应板的每个孔中。

5. 从每个细菌培养液（见上面第 2 步）中，各取 1ul, 加到装有主体混合液的各 PCR 管或 PCR 板的各个孔中。

6. 用下面的条件，不使用矿物油在热循环仪中进行 PCR。

7. 从每个反应中各取 4ul 在 2% 琼脂糖凝胶上分析。

第 2 阶段：斑点印迹分析

一、材料

1. 缓冲液、溶液和试剂

0.6mol/LNaOH(新鲜配制，或从浓的储存液中新稀释）

SSC，20X(1L 配方：175.3 gNaCl 和 88.2 g 柠檬酸钠，pH7.0)

0.5mol/LTris-HCl，pH7.5

2. 核酸和寡核苷酸

PCR 产物

3. 专用设备

微量滴定板

尼龙膜

紫外交联装置（比如 Stratagene 的 UVStratalinker)，或 68°C 烘箱

96 孔或 384 孔复制器

二、方法

1.从每个 PCR 产物中，各取 5ul, 与 5ul 0.6mol/LNaOH 混合。

2.从每个混合液中，各取 1~2ul 到尼龙膜上。这一步可以使用 96 孔或 384 孔复制器在用作 PCR 扩增的微滴定板相应的孔中蘸一下，再点到一块干的尼龙膜上。至少点 2 张同样的膜，分别用来与正向和反向消减探针进行杂交（方案 1 第 3 阶段）。强烈推荐点 4 张相同的尼龙膜。2 张与正向和反向的消减 DNA 进行杂交，另外 2 张与最初的 cDNA 或基因组 DNA 进行杂交。

3.用0.5mol/LTris-HCl(pH7.5) 中和 2~4 min, 并用 2XSSC 洗涤。

4.用紫外交联装置（比如 Stratagene 的 UVStratalinker) 将 DNA 固定在膜上，68°C 烘烤 4 h。