试剂、试剂盒 液氮 组织胍溶液 十二烷基肌氨酸钠 CsCl 组织重悬液 乙酸钠酚 氯仿 异戊醇 异戊醇 无水乙醇

仪器、耗材 组织捣碎机 离心机

实验步骤

一 材料与设备

1）液氮

2）组织胍溶液：590.8 g 异硫氰酸胍溶于 400ulDEPC 处理的水中，加入 25 mmol/LTris-Cl(pH7.5).20 ml0.5mol/LEDTA(pH8.0)，搅拌过夜，加水至 950 ml，过滤, 最后加 50 ml，β-巯基乙醇。

3）20%(m/V) 十二烷基肌氨酸钠

4）5.7mol/LCsCl

5）组织重悬液:5 mmo/LlEDTA，0.5%(V/V) 十二烷基肌氨酸钠，5%β-巯基乙醇

6）3mol/L 乙酸钠 pH5.2

7）酚：氯仿：异戊醇 (25:24:1)，氯仿：异戊醇 (24:1)

8）组织捣碎机

9）离心机

10）无水乙醇.

二 操作方法

1) 从动物体快速取出组织，切成小于 2 g 的小组织块. 在液氮中速冻，每 2 g 小组织块加人 20 ml 组织胍溶液 (不含十二烷基肌氨酸钠）后立即在组织捣碎机中研磨 2〜3 次，每次 10s. 速冻是关键，因为将组织放在胍溶液中等候捣碎时，RNA 会发生降解

2) 于 12℃12OOOg 离心 10mim。上清加人 0.1 倍体积的 20% 十二烷基肌氨酸钠，65℃ 加热 2 min

3) 每毫升液体加人 O.lgCsCl，并使之溶解。将样品加于已高压及硅化处理离心管中的 9 ml5.7mol/LCsCl 垫层之上。于 22℃113000 g 离心过夜。

4) 小心移去上清. 倒转离心管以使剩余液体流干。切下离心管的底部（含 RNA 沉淀）将其放在一个 50 ml 塑料管中，加人 3 ml 组织重悬液在 4℃ 溶解沉淀，可过夜或更久。

5) 依次以酚：氯仿：异戊醇（25:24：1）和氯仿：异戊醇 (24:1) 抽提溶液。

6）加入 0.1 倍体积的 3moI/LPH5.2 的乙酸钠缓冲液和 2.5 倍体积的无水乙醇，沉淀，重溶 RNA 于水，定量和储存。