实验方法原理 利用硝酸纤维素滤膜结合可以测定蛋白与 DNA、RNA 间的结合，该方法的基础在于大多数蛋白可以与硝酸纤维素滤膜结合，如果蛋白质和核酸结合，那么该复合物也可以与硝酸纤维素滤膜结合，但是这种结合必须能够 承受过滤压力，并且蛋白质在结合到硝酸纤维素滤膜上时还能够保持与核酸的结合，但有些蛋白质在结合到硝酸纤维素滤膜上后会变性。
实验材料 核酸酶
试剂、试剂盒 缓冲液
仪器、耗材 硝酸纤维素滤膜灭菌瓶聚丙烯微量滴定板点杂交装置移液器微孔玻璃过滤装置
实验步骤
一、材料与设备
所有缓冲液必须用去除离子、有机物和生物污染的去离子水配制，但是核酸酶污染还是一个常见的问题，每个溶液必须采用硝酸纤维素滤膜过滤除去核酸酶，溶液储存在灭菌瓶中。使用移液管或塑料吸头转移液体，使用高纯度的试剂以避免核酸解的污染，否则可能造成解离常数的改变。
1. 点杂交所用装置如下：
(1) 4 英寸 X 5 英寸的 Schleicher 和 Schuell （Keene 公司，NH，USA）0.2 μm 硝酸纤维素滤膜 ( BAS ) 或者 4 英寸 X 5 英寸的 DEAE 膜和 4 英寸 X 5 英寸的 Schleicher 和 Schuell 0.15 μm 的硝酸纤维素滤膜（BA45）。
(2) 96 孔聚丙烯微量滴定板。
(3) 点杂交装置。
(4) 八道移液器。
2. 单个滤膜装置：
(1) 硝酸纤维素滤膜：Schleicher 和 Schuell BA85 0.45 μm 或 0.2 μm 的滤膜。
(2) 25 mm 微孔玻璃过滤装置。
将硝酸纤维素滤膜置于塑料袋中储存在 4℃ 防止干燥，陈旧的滤膜容易发生不均匀的湿润，干燥时易碎而变得不可靠。必须记住当过度加热或者敲击时硝酸纤维可以发生破裂，陈旧的则更加易碎。
聚丙烯微量滴定板使用前在 1 mol/L HCl 中浸泡 30 min，以去除痕量的 RNase 或黏附的蛋白，这样处理后可以多次使用。聚羧酸酯或聚苯乙烯板没有杭酸性能，更容易在表面黏附蛋白。
二、操作方法
1. 在合适的缓冲液和温度下预先湿润硝酸纤维素滤膜，此过程至少要 30 min，保证所有的面都接触到缓冲液，没有被缓冲液充分饱和的滤膜必须丟弃，避免手指接触到滤膜。
2. 在微量滴定板上加入一定体积的样品，用不断增加的蛋白滴定定量的 32P 标记 RNA，用仅含 RNA 的孔作为对照，测量滤膜非特异性的 RNA 结合能力，一个常规的曲线应该涵盖 3 到 4 个蛋白浓度的数量级，每组最少 5 个点（推荐更多的点来更准确的确定 中间点），高于（饱和）或低于（未饱和）基线的点都要适当。每个试验平行进行两次并取平均值。
3. 在润湿后去除过量的缓冲液，用 Kimwipe 轻微封闭制备滤膜，以防止样品在膜上的扩散。
4. 在过滤前，将膜插入到装置中，打开真空泵即将样品从板转移到滤器，从最低浓度的蛋白样品开始滴加，逐渐到高浓度，同一个滴头可以在一个滴定过程中使用，过长时间的吸滤将导致过多滞留，因此此步必须迅速，所以在一个滴定时使用同一吸头。在滤膜 和溶液之间可能产生气泡而阻止过滤，这些气泡必须清除，轻拍装置的边缘即可以达到目的。过分浓缩的蛋白在抽吸时也可能产生泡沬，这是蛋白变性的标志，所得结果也就不准确。
5. 移去滤膜小心吸干底下过量的缓冲液，以防止在表面扩散，导致单个的点变得模糊。
6. 采用感光成像仪测定结合在滤膜上的 RNA，可以在滤膜干燥或潮湿时进行，如果膜是湿润的，将其包裹在 Saran 膜中再进行测定。直接测定结合的放射标记的 RNA 量， 结合量 (B) 和总量（T）直接进行比较，在没有蛋白的情况下结合到膜上的 RNA 作为背景 ( O )，从每个数据点去除，得到（B-O）/T=FB（片段结合），FB 对蛋白质浓度的对数作图即得到结合等温线。
7. 分析结合检测结果，复合物的形成假设为两个分子的结合，结合的化学式是 1:1，在 Langmuir 等温线中查到数据对应的值即得到解离常数，下面是 Lin 和 Riggs 给出的公式：
常数 C 适合于基线以上（即当滞留率不足），可以用来标准化变化的滞留率。仅当一个单个数据列被标准化以后，才可以用复制的数据列进行分析，因此从最初的过滤获得 C 值，每个 FB 除以参数 C 得到 FBnom，它作为蛋白浓度的一个函数，用 FBnom 代替 FB，去掉 C（或设为 1）再做一次。为了分析单个的数据列，一个 Macintosh 系统下的绘图软件例如 KaleidaGraphTM 或 PC 就足够了（Synergy Software），其他的一些软件包可以处理更加复杂的分析，包括 ScientistTM（MicroMath Sciennfic Software 公司）。
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