实验方法原理 剪接反应的典型做法是使用核提取物，即 S100 提取物补充 SR 蛋白或粗提取物的部分纯化组分，最常使用的是 HeLa 细胞的提取物。前体 mRNA 底物通常采用噬菌体聚合酶体外转录的方法来制备。
实验材料 tRNAUTPRNA 聚合酶
试剂、试剂盒 YPTris-HCl ETDASDS甘油HEPES 钾盐DTTPMSF磷酸钾缓冲液D-山梨醇SB 缓冲液等渗液裂解液AGK 缓冲液TBETE 亚精胺转录缓冲液NTPATP二氯乙酸乙酸钠RNA 洗脱缓冲液乙酸铵乙醇染色液蛋白酶 K 溶液乙酸钠-EDTA 溶液Tris 碱平衡酚过硫酸铵硅烷化溶液RNasin
仪器、耗材 离心机摇床Dounce 匀浆器瓷质研钵研杵透析袋Dewar 烧瓶防低温手套真空滤膜架电源玻璃板聚四氟乙烯梳子和垫片黄色胶带聚丙烯培养试管Quicksep 柱台式振荡器旋转真空浓缩仪
实验步骤
一、材料与设备
1. 剪接提取物制备用溶液
除非另有说明，所有溶液均以蒸馏水制备。
(1) YP：加 20 g 酵母提取物和 40 g 蛋白胨（hacto peptone ) 到 1 L 的去离子水或者蒸馏水中。加 50 g 无水 D-葡萄糖到 70 ml 水中并在加热盘上搅拌溶解，用水补充至 100 ml 以制备 50% ( m/V ) 的葡萄糖溶液。将 YP 在一带塞的 2800 ml Fcrnbach 烧瓶或者 4 L 烧瓶中高压灭菌，50% 葡萄糖存放在带螺丝帽的瓶中，于室温储存。使用前每升 YP 加 40 ml 的 50% 葡萄糖。葡萄糖在高压火菌后再加入 YP 中，以防止因高压灭菌过久而焦糖化。
(2) 1 mol/L Tris-HCl ( pH 7.6，pH 7.8 和 pH 8.0）：加 30.29 g Tris 碱到 125 ml 水中，接着加入 92 ml 1 mol/L HCl。用 1 mol/L HCl 滴定调 pH 至 7.6，7.8 或者 8.0，加水至 250 ml。高压灭菌后室温保存。
(3) 4 mol/L NaCl，高压灭菌后室温保存。
(4) 0.5 mol/L ETDA ( pH 8.0 )：加 18.6 g 的 EDTA ( 二钠二水合物形式）到 75 ml 的水中溶解 EDTA 并用 10 mol/L NaOH 将 pH 调至 8.0。加水至 100 ml。高压灭菌后室温保存。
(5) 10%（m/V）SDS，室温保存。
(6) 50%（m/V）甘油，高压灭菌后室温保存。
(7) 1 mol/L MgCl2，高压灭菌后室温保存。
(8) 2 mol/L KCl，高压灭菌后室温保存。
(9) 1 mol/L HEPES 钾盐（HEPES-K+），23℃ 时 pH 为 7.8：加 119.2 g HEPES 和 20.1 g KOH 到 400 ml 的水中，加水至总体积 500 ml。稀释一小份样品到 10 mmol/L，检测 23°C 时其 pH 是否为 7.5，必要时可用 2 mol/L HCl 调节 pH。在 4℃ 其 pH 应为 7.8。高压灭菌或者过滤除菌后于 -20℃ 保存。溶液在高压灭菌后可能有点发黄，但不影响使用。
(10) 1 mol/L DTT：DTT 固体储存在 -20°C，该溶液保存于 4℃，应该在 24 h 内使用。
(11) 0.5 mol/L PMSF，-20℃ 保存。
(12) 1 mol/L 磷酸钾缓冲液（pH 7.6）：慢慢将 8.85 g KH2PO4 和 75.75 g K2HPO4 加入到 400 ml 水中，溶解后，其 pH 应该是7.6，然后把总体积调到 500 ml 并高压灭菌。室温保存。
(13) 酶解酶溶液 ( zymdyase)：用 20 mmol/L 磷酸钾、5% 葡萄糖的缓冲液配制 20 mg/ml ( pH 7.6 ) 的酶解酶溶液，用前配制。酶解酶-100T ( 100000 U/g ) 固体于 4°C 储存。从 1 L 的细胞培养物中制备提取物需 10 mg 的酶解酶。酶解酶不能完全溶解，但不影响使用。
(14) 2 mol/L D-山梨醇：高压灭菌，室温保存。
(15) SB 缓冲液：1 mol/L 山梨醇，50 mmoI/L Tris-HCl ( pH 7.8），10 mmol/L MgCl2，室温保存。加 1.5 ml 的 1 mol/L DTT 到 50 ml 的 SB 中以制备新鲜的 SB+30 mmol/L DTT。加 0.75 ml 的 1 mol/L DTT 到 250 ml 的 SB 中以制备新鲜的 SB+3 mmol/L DTT。
(16) 等渗液：1 mol/L 山梨醇，以水稀释 2 mol/L 山梨醇至 1 mol/L。
(17) 裂解液：0.1%（m/V）SDS，50 mmol/L EDTA。
(18) 缓冲液 A：10 mmol/L HEPES-K+ ( pH 7.8 )，1.5 mmol/L MgCl2，20 mol/L KCl，0.5 mmol/L DTT，0.5 mmol/L PMSF。新鲜制备并置于冰上。加 1 ml 的 1 mol/L HEPES-K+ ( pH 7.8 )，150 μl 1 mol/L MgCl2，1 ml 2 mol/L KCl 和 50 μl 1 mol/L DTT 到97 ml 的灭菌水中，仅在使用前才加入 100 μl 0.5 mol/L PMSF。注意 PMSF 在水溶液中的半衰期大约为 30 min。加入 PMSF 时会产生少量沉淀但不影响使用。
(19) 缓冲液 D：20 mmol/L HEPES ( pH 7.8)，0.2 mmol/L EDTA，50 mmol/L KCl，20% 甘油( V/V )，1 mmol DTT，0.5 mmol/L PMSF，从 1 L 细胞培养物中制备提取物，须提前一天准备 2 L 的缓冲液 D。高压灭菌，置冷室冷却过夜。在透析前加 1 ml 1 mol/L DTT 和 1 ml 0.5 mol/L PMSF。
(20) AGK 缓冲液：10 mmol/L HEPES-K+ ( pH 7.8 )，1.5 mmol/L MgCl2，200 mmol/L KCl，10% （V/V）甘油，0.5 mmol/L DTT 和 0.5 mmol/L PMSF。使用前才加 PMSF。
2. 体外转录和剪接分析用溶液
(1) 10X TBE：890 mmol/L Tris-硼酸，25 mmol/L EDTA（pH 8.3）。室温保存。
(2) 1X TBE：用蒸馏水或者去离子水稀释 10XTBE 至 1XTBE，室温储存。
(3) 1XTE：10 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.6 )，1 mmol/L EDTA。室温储存。
(4) 30%（m/V）PEG8000，50℃ 加热溶解，高压灭菌，溶液冷却后分装为每份 1 ml 和 10 ml，于 -20℃ 储存。
(5) 1 mol/L 亚精胺：1.27 g 三盐酸亚精胺（spermidine trihydrochloride ) 溶于 3.5 ml 灭菌水中，用 10 mol/L NaOH 调整 pH 至 7.6，加水到 5 ml。-20℃ 保存。
(6) 10X 转录缓冲液：0.4 mol/L Tris-HCl（pH 7.8)，60 mmol/L MgCl2，40 mmol/L 亚精胺。500 μl 每份储存于 -20℃。
(7) 0.1 mol/L DTT：用水稀释 1 mol/L DTT 至 0.1 mol/L，500~750 μl 每份储存于 -20℃。
(8) 10X NTP：ATP、GTP、CTP 各 5 mmol/L，UTP 1 mmol/L( pH 7.0)，储存于 -20℃ 使用时 37℃ 水浴迅速解冻并放在冰上。
(9) 100 mmol/L ATP：储存于 -20℃。使用时 37℃ 水浴迅速解冻并放在冰上。
(10) 二氯乙酸（TCA)：将 500 g TCA 加入 227 ml 的水中制备 100% TCA。在量筒中分别稀释 10 或 20 倍以制备 10% 和 5% 的 TCA。
(11) 3 mol/L 乙酸钠（NaAc) ( pH 5.4)：加 40.82 g 的二水乙酸钠至 75 ml 水中，加冰乙酸调 pH 到 5.4，最后加水至 100 ml。高压灭菌，室温保存。
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