4. 免疫印迹检测外源蛋白的展示情况
pDTSPLAY-B 空载体生成的噬菌体表面不含外源基因，仅有带有 6 个组氨酸标签和 Myc 标签的锚定蛋白（基因 Ⅲ 编码），此蛋白 SDS-PAGE 中的条带在 65 kDa 的位置（实际 Mr 为 45 kDa）。pDISPLAY-B 载体中插入外源蛋白编码基因后，条带迁移率会明显变慢。同时电泳两块 SDS-PAGE 胶，一块胶用考马斯亮蓝染色观察蛋白上样量，另一块胶转膜进行免疫印迹检测。
(1) 电泳及转膜
制备常规 8% SDS-PAGE 胶，取 10 μl 噬菌体样本，加入 10 μl 2X 蛋白电泳上样缓冲液，100℃ 加热 5 min 变性。同时制备两份同样的样品上样电泳。电泳完成后，一块胶用考马斯亮蓝染色 15 min 至 60 min，脱色后观察蛋白上样量。另一块胶用电转移的方法将蛋白转至硝酸纤维素膜，再进行下一步的免疫印迹检测。
(2) 免疫检测
常规操作，经过封闭，一抗孵育，二抗孵育，NBT/BCIP 显色，对结果进行分析。
空载体对照样本应在 65 kDa 处出现一阳性条带，含有外源基因的展示噬菌体样本应该在大于对照样本的位置出现一阳性条带（条带的大小取决于插入基因的长度）。通过免疫印迹检测不仅可以了解外源蛋白是否得到展示，还可以了解蛋白展示的相对含量。有时可能会检测到展示蛋白的降解带（外源蛋白的降解可能发生在噬菌体的包装过程）。但是，由于免疫印迹并不能显示噬菌体展示蛋白的功能，如有些蛋白虽然能够表达，但因为折叠的错误可能会导致不再具备 RNA 结合的功能；因此还需要进一步对所展示的蛋白的 RNA 结合活性进行检测。
5. 噬菌体展示蛋白的 RNA 结合活性进行检测
(1) 靶 RNA 的制备
① 将靶 RNA 序列通过 HindⅢ 和 PstⅠ 两个酶切位点插入 pGEM 衍生载体，构建重组克隆 [ 重组克隆的构建可以采用人工合成靶 RNA 序列所对应的 DNA 序列及互补 DNA 序列（各约 70 个核苷酸），将合成的双链进行体外退火后再克隆到载体 ]。转录前以 AvaⅠ 酶切重组质粒，线性化后的质粒需经过纯化才能作为转录模板。按照 Mega ( short ) scrip kits 试剂盒所描述的方法转录获得靶 RNA ( 通常采用 8 μg 模板 DNA 每 20 μl 反应体系）。
② 转录获得的 RNA 经酚：氯仿抽提，乙醇沉淀进行纯化。
③ 配制 5%~8% 的变性丙烯酰胺胶，275 V 室温预电泳 30 min。
④ 用 4 μl TE 溶解沉淀获得的 RNA，加入 4 μl 甲酰胺和 2 μl 上样缓冲液，85°C 加热 5 min，上样，250 V 电泳 1~2 h。
⑤ 凝胶用含 10 μg/ml 溴化乙锭的 1X TBE 振摇染色 15 min；1X TBE 振摇脱色 2 次，每次 10 min。
⑥ 切胶获取目的 RNA 带，将切下的含靶 RNA 的胶放入底部扎眼的 0.5 ml 管中，再放入 1.5 ml 离心管中，离心 2 min 破碎胶。
⑦ 在盛胶的管内加入等体积 TE、0.2% SDS，混合 1 h 或 4℃ 过夜。将混悬液加入无菌的 Sephadex G-50 柱，150 g 离心 2 min，洗脱液收集至一干净的离心管内。
⑧ 再在 Sephadex G-50 柱内加入 50 μl TE/SDS，再次 150 g 离心 2 min，洗脱液收集入同一个离心管内。
⑨ 酚：氯仿抽提一次，氯仿再抽提一次。将上清转移至新的离心管中，加入 1/10 体积加 3 mol/L 乙酸钠、2.5 倍体积乙醇沉淀，70% 乙醇洗盐，最后溶解于 50 μl TE 中。
⑩ 1：100 稀释 RNA 溶液，检测 A260，计算 RNA 浓度（= 40 μg/ml X A260）。同时，取 40 pmol RNA 电泳，检测 RNA 的回收率和是否降解。
(2) RNA 与链亲和素顺磁珠结合
链亲和素顺磁珠的结合能力为每 10 μl 链亲和素顺磁珠可以结合 2~5 pmol 退火的 RNA，这相当于 ≥1012 个结合位点（按每个 RNA 含一个结合位点推算），因此 10 μl 链亲和素顺磁珠进行结合反应后可以多次使用。
第一次进行 RNA 与链亲和素顺磁珠结合的实验时，最好检测一下 RNA 与 DNA 寡核苷酸的退火效率。可以用恒定量的放射性标记的 RNA 同不同量的 DNA 寡核苷酸进行反应，用非变性胶电泳检测。与 DNA 寡核苷酸退火的 RNA 电泳迁移率明显减慢。放射性标记的退火的 RNA 同样可用于 RNA 与链亲和素顺磁珠结合程度的检测。
① 取 5 pmol RNA（1 μl），5 pmol 寡核苷酸（1.5 μl）混匀，85°C 加热 3 min。
② 样品放置 3 min 冷至室温。
③ 加入 1 倍体积 2X TENT 结合缓冲液。
④ 取 10 μl 链亲和素顺磁珠，用 1 倍体积 1 mol/L NaOH、0.1 mol/L NaCl 洗 2 次；再用 1 倍体积 0.1 mol/L NaCl 洗 2 次。
⑤ 1 倍体积 1X TENT 结合缓冲液重悬磁珠。
⑥ 去除缓冲液，加入 DNA/RNA 双链体（5 pmol ) 和 5 μl tRNA（40 μg），混合后置于室温 30 min。
⑦ 用 1X TENT 缓冲液洗 3 次，去除末结合的 RNA。
⑧ 用 10 μl 1X TENT 缓冲液重悬。
(3) 展示噬菌体与链亲和素顺磁珠结合
通过滴度检测可以知道噬菌体颗粒的数量，然后将噬菌体样本与含有过量靶 RNA 的磁珠混合，通过洗脱非特异结合得到特异性结合的噬菌体的数量。结合的噬菌体数目与最初的噬菌体数目的比值就是结合率。在实验体系中加入 lacZ 标记的噬菌体。在含有 X-Gal 的培养板上，lacZ 标记的噬菌体转染的宿主菌形成蓝色克隆。计数筛选前后的蓝色克隆数目就可以获得非特异本底结合的数据，此外，也可以通过设置未结合 RNA 或结合了无关 RNA 的磁珠实验组作为本底结合的对照。
① 噬菌体结合反应混合物：在 1X TENT 结合缓冲液中加入约 1X1010 集落生成单位制备好的 “展示” 噬菌体、40 μg tRNA，40 U RNasin，总体积为 30 μl。同时还可以在反应混合物中加入 5 倍过量的 lacZ 标记的噬菌体。可以多配一部分反应混合物，多出的部分可用于检测最初反应混合物中的噬菌体的数量。
② 去除结合有 RNA 的顺磁珠中的缓冲液，加入噬菌体结合反应混合物，室温轻柔振摇反应 30 min。
③ 用 1X TENT 缓冲液快速洗磁珠 2 次，再用 100 μl 1X TENT 缓冲液重悬磁珠。
④ 将这 100 μl 样品进行 6 次 1：100 稀释（5 μl→495 μl），分别取 100 μl 10-8，10-10 和 10-12 稀释液，各加入 100 μl 宿主菌，37℃ 培养 30 min，涂布 LB 板（含 100 μg/ml 青苄青霉素，2% 葡萄糖和 40 μg/ml X-Gal）。同时设置未与顺磁珠反应的噬菌体结合反应混合物 [ 来源于步骤 (1) ] 不同稀释倍数的对照。
⑤ 将培养板在 37℃ 孵育过夜，第二天计克隆数。在进行结合筛选后，蓝色克隆与白色克隆的比例应明显降低，这种比例通过选择性结合后会显著性降低，一般情况下，2%~5% 的展示噬菌体可以同 RNA-磁珠结合，本底结合应低于 0.005%。因此，通过一轮的选择性结合后可以使目的噬菌体的纯度提高 3~4 个数量级。
6. RNA 结合蛋白的体外筛选
噬菌体展示技术适于研究 RNA-BP 中的 RNA 结合结构域与 RNA 间的相互作用。可以对通过蛋白质中的 RNA 结合结构域进行突变（随机突变或选择性突变某些可能具有活性功能意义的氨基酸），来深入研究蛋白质与 RNA 相互作用的分子机制。在构建噬菌体展示库时，有 2 种经常采用的方法。一种是将 RNA-BP 编码基因的一部分用含有一个或多个随机突变区的合成寡核苷酸取代的方法，另一种方法是用部分随机寡核苷酸作为引物进行 PCR 扩增，再将 PCR 产物整合到目的基因的方法，突变方法的选择影响着研究所涉及的氨基酸的广泛性。由于细菌转化本的限制（最好控制在 1010），复杂性大于1010 的库无法在一次实验中全面筛选。这并不是说不能使用大于 1010 的库，只是意味着对于复杂的库进行研究分析时，一次筛选过程无法对所有的克隆均进行分析。对于一个完全随机的突变库，对应每一个氨基酸位点都有 21 种可能性（20 种氨基酸加上终止密码），如果希望所构建的库能够代表所有的突变可能，那么，最多只能对 7 个氨基酸进行随机突变。因此要根据实际研究的问题来确定构建突变体库的方法和策略。
(1) 噬菌体展示库的制备
① 用构建好的噬菌体展示库转化宿主菌，按每 25 cm X 25 cm 板不超过 100000 个克隆的密度涂布 LB 板（含 100 μg/ml 氨苄青霉素和 2% 葡萄糖）。如果库容量过大，就需要在含 100 μg/ml 氨芐青霉素和 200 μg/ml 的甲氧苯青霉素培养液中液相培养数小时。液相培养的不足之处就是一些具有生长优势的克隆会得到较大比例的扩增。
② 用 2X YT 培养液刮取培养板上长出的克隆，加入 16% 甘油，-80℃ 保存。液相培养的细菌经过离心后用少量 2X YT 重悬，加入 16% 甘油，-80℃ 保存。这是第一代库保存液，称 R-0 ( Round-0）。可以通过对 R-0 中数个单克隆样本或多克隆样本进行测序来 检定突变库的质量。
③ 取适量 R-0 噬菌体库甘油保存液，在 30 ml 2X YT（含 100 μg/ml 氨苄青霉素和 2% 葡萄糖）培养液中培养至 OD600 达 0.5，用辅助噬菌体进行感染，方法同前面3 “制备展示噬菌体”。
(2) 体外检测噬菌体展示库与靶 RNA 的结合
筛选方法的选择取决于噬菌体展示库的复杂性。如果是对一个复杂性很高，克隆很多，并且具有不同的亲和力的库进行筛选，最好采用前面介绍的预先用过量的 RNA 与磁珠结合的筛选方法。如果所研究的噬菌体库展示蛋白与 RNA 的亲和力彼此相近，则可以采用较为严谨的筛选方法，降低靶 RNA 的浓度；噬菌体先与 DNA-RNA 双链体共孵育，再与磁珠结合。除了方法的选择外，还应注意在实验过程中设置对照以方便结果分析。每天培养新鲜的宿主菌以方便滴度测定。
① 第一天按 1：500 稀释过夜培养宿主菌至 LB 培养液，37°C 250 r/min 振摇培养 6 h，用于滴度检测。在结合缓冲液中加入噬菌体展示库和 RNA-DNA 双链体（制备方法同前，先将 RNA 与 DNA 退火，再将其稀释至合适的浓度，如 RNA 浓度接近或低于 Kd），结合缓冲液中应具备合适的盐浓度、2 μg/μl tRNA 和 2 U/μl RNasin。
② 结合反应达平衡后，加入磁珠（预洗方法同前），室温缓慢旋转反应 30 min。
③ 用 1 ml 结合缓冲液快速洗磁珠 2 次，再用 100 μl 结合缓冲液重悬磁珠。获得 R-1（round-1）噬菌体，4°C 保存。
④ 连续稀释 R-1 噬菌体样品，分别取 100 μl 10-4 稀释液、10-6 稀释液和 10-8 稀释液，各加入 100 μl 宿主菌，37℃ 培养 30 min，涂板进行滴度检测。同时测定未经结合筛选的噬菌体的滴度以进行比较。
⑤ 第二天，按 1：500 稀释过夜培养宿主菌至 LB 培养液，37°C 250 r/min 振摇培养 6 h，用于滴度检测。
⑥ 计数用于滴度测定的培养板上的克隆数，计算末经结合筛选的噬菌体和 R-1 噬菌体的滴度、及筛选过程中噬菌体结合的比例。
⑦ 用适量的 R-1 噬菌体感染步骤 (5) 中稀释扩增的宿主菌，使宿主菌过量以保证噬菌体的感染率（1：500 稀释后培养 6 h 约为 104 细胞/ml），37℃ 培养 30 min。
⑧ 将感染的细胞涂布 LB 板（含 100 μg/ml 氨芐青霉素和 2% 葡萄糖），37°C 过夜培养。
⑨ 第 5 天，用 2X YT 培养液收集培养板上长出的克隆，加入 15% 甘油，制备出 R-1 噬菌体库，-80℃ 保存。此噬菌体展示库又可以用辅助噬菌体进行感染，进行下一轮的蛋白展示、RNA 结合、感染宿主菌、筛选结果分析等工作。
7. 结果分析
每次通过与 RNA 的结合对噬菌体进行筛选之后再对噬菌体滴度进行检测不仅有助于了解每次实验操作中所筛选的噬菌体的数量，还可以了解到筛选的进行程度。经过筛选，一定比例的噬菌体被磁珠结合而富集；当与磁珠结合的噬菌体比例达到平台时，表明 噬菌体展示的蛋白结构域与 RNA 的亲和力相近的克隆得到了筛选。这时就可以停止筛选或者是提高筛选的严谨性。要达到何种程度的筛选目的决定着筛选次数：如果是为了筛选得到与特异序列具有强结合力的突变蛋白，最好的结果就是通过多轮筛选获得单一的高结合力的克隆；如果只是对一段蛋白中一些氨基酸与靶 RNA 结合中的相对重要性进行研究，就需要对一些在筛选过程中得到富集的克隆进行序列分析以寻找规律，而获得单一的高结合力的克隆在这种分析中是没有意义的。
起始库的大小对于筛选次数也有很重要的影响。被筛选的库越复杂，所需要的筛选次数就越多。由于需要的筛选次数无法预测，所以只能以筛选过程中噬菌体的结合量作为判断标准。一旦结合水平不再升高，就可以停止筛选，通过测序等手段对筛选结果进行 分析。通过筛选可能获得与 RNA 结合的一些保守序列等结果，当然这些结果还需要其他实验的证实。
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