用RNA的免疫沉淀-rPCR方法进行体内分离核糖核蛋白复合体实验
实验方法原理 RNA 免疫沉淀-随机聚合链反应方法可用来鉴定细胞内 RNP 复合物中的 RNA 组分。
实验材料 载体酵母 tRNARQ1 DNA 酶糖原小牛肠碱性磷酸酶T4 DNA 连接酶JMJ09 感受态细菌
试剂、试剂盒 PBSNET-2 缓冲液RNase 抑制剂酚氯仿 异戊醇乙酸钠乙醇M-MLV 反转录酶反转录缓冲液通用引物-dN6RNase H电泳缓冲液非变性琼脂糖凝胶上样缓冲液EcoR Ⅰ限制性内切核酸酶EDTA
仪器、耗材 蛋白 A 琼脂糖凝胶无 RNA 酶离心柱PCR 扩增体系Promega PCR 试剂盒pGEM-7Z 质粒载体 Falcon 2059 聚丙烯管SOC 培养基LB 平板培养基fmol DNA 循环测序系统微型凝胶水平电泳仪紫外透射仪PCR 扩增仪高速低温离心机低温微型离心机台式低温离心机旋转真空浓缩仪
实验步骤
一、材料与设备
1. 细胞提取物的制备
(1) 无菌 1X PBS。
(2) NET-2 缓冲液：50 mmol/L Tris-HCl （pH 7.4），150 mmol/L NaCl，0.05% （V / V） NP-40。
(3) RNase 抑制剂。
2. 免疫沉淀
(1) 蛋白 A 琼脂糖凝胶。
(2) 载体酵母 tRNA（1 mg/ml）。
(3) RNase 抑制剂。
(4) NET-2 缓冲液。
(5) RQ1 DNA 酶（Promega 公司）。
(6) 酚：氯仿 ( 1 : 1 )，避光保存。
(7) 氯仿：异戊醇 ( 24：1 )。
(8) 3 mol/L 乙酸钠（pH 5.2 )。
(9) 糖原。
(10) 无水乙醇及 80% 乙醇。
(11) DEPC 处理的水。
3. RNA-rPCR 方法
(1) M-MLV 反转录酶和反转录缓冲液：50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.3），10 mmol/L DTT，3 mmol/L MgCl2，dNTP ( 每种 0.5 mmol/L），1 U RNase 抑制剂，50 U M-MLV 反转录酶。
(2) 通用引物-dN6：5' -GCCGCTCGAGTGCAGAATTCNNNNNN-3'。
(3) RNase H。
(4) 第二链 cDNA 合成：DNA 聚合酶Ⅰ Klenow 大片段，10X DNA 聚合酶ⅠKlenow 大片段反应缓冲液，dNTP 混合液（每种 25 mmol/L）。
(5) 酚：氯仿（1 : 1），避光保存。
(6) 氯仿：异戊醇（24 : 1）。
(7) G-50、D-RF 无 RNA 酶离心柱（5-Prime，3-Prime 公司）。
(8) PCR 扩增体系：Taq DNA 聚合酶、10X PCR 缓冲液 [ 100 mmol/L Tris-HCl ( pH 8.3)，500 mmol/L KCl，15 mmol/L MgCl2，0.1% 明胶 ] 、dNTP 混合液（每种 10 mmol/ L）。
(9) 通用引物：5'-GCCGCCGAGTGCAGAATTC-3'。
(10) DEPC 处理的水。
(11) 电泳缓冲液：1X TBE。
(12) 10X 非变性琼脂糖凝胶上样缓冲液：0.25% 溴酚蓝，0.25% 二甲苯青，15%（m / V）Ficoll 400，溶于去离子水。
4. 构建 cDNA 质粒文库及转化
(1) Promega PCR 试剂盒。
(2) EcoR Ⅰ限制性内切核酸酶。
(3) pGEM-7Z 质粒载体 ( Promega 公司）。
(4) 小牛肠碱性磷酸酶及其 10X 缓冲液。
(5) 0.5 mol/L EDTA。
(6) 酚：氯仿（1 : 1)，避光保存。
(7) 氯仿：异戊醇（24 : 1 )。
(8) 3 mol/L 乙酸钠（pH 5.2 )。
(9) 无水乙醇和 80% 乙醇，-20℃ 储存。
(10) T4 DNA 连接酶及其 10X 缓冲液。
(11) JMJ09 感受态细菌。
(12) Falcon 2059 聚丙烯管。
(13) SOC 培养基。
(14) LB 平板培养基（100 μg/ml 氨苄青霉素）。
5. 克隆筛选
(1) TE 缓冲液：10 mmol/L Tris- HCl ( pH 7.4 )，0.1 mmol/L EDTA。
(2) PCR 反应体系，见3"RNA-rPCR 方法"。
(3) SP6 及 T7 启动子引物。
(4) 酚：氯仿（1 : 1)，避光保存。
(5) 氯仿：异戊醇(24 : 1)。
(6) 3 mol/L 乙酸钠（pH 5.2)。
(7) 非变性琼脂糖凝胶。
(8) 电泳缓冲液 1X TBE。
(9) 10X 非变性琼脂糖凝胶上样缓冲液，见3 “RNA-rPCR 方法”。
(10) fmol DNA 循环测序系统（Promega 公司）。
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