二、机械法裂解细胞

超声和高压裂解已经被高效地应用于微生物、植物和动物细胞的裂解。这些方法已经采用了几十年，其设备和原理已经被详细阐明（Harrison,1991;Hopkins，1991;Mid-delberg，1995)。超声裂解是通过调谐的探头或机臂的共鸣（15~25kHz) 所引发的髙频超声波振荡产生的剪切力来工作的。在音速的压力波作用下，液体中产生微小气泡并随后塌陷，该过程所产生的内爆产生具有足够能量的冲击波从而使细胞壁裂解，并且剪切核酸使样品的黏度降低。

髙压勻浆机 (high-pressurehomogenizer) 和压力挤出机 (pressureextruder) 是通过使强制加压后的细胞悬液通过狭窄的孔口阀 (orificevalve) 来工作的。这种阀可能只是一个简单的限流针孔阀 (restrictingneedlevalve)(如弗氏细胞压碎器），也可能是更加复杂的带有组合的阀座和冲击环的设计 (如在 APVManton-Gaulin 匀浆机中）。裂解的机制是借助于在压力挤出的喷嘴处的压差和剪切力来裂解细胞。压力勻浆机裂解细胞的多种机制已经被提出，包括紊流 (turbulence)、空化 (cavitation)、黏性剪切（viscousshear) 和碰撞 (impingement)(KleinigandMiddelberg，1998;Pandolfe，1999)。普遍认为在破碎过程中并不存在完全单一的作用机制。然而，空化和碰撞被认为是细胞裂解的主要作用因素（Shirgaonkaretal」1998;SPXCorp.，2009)。

用玻璃珠研磨悬液中的细胞来裂解细胞是在实验室规模和生产规模下都比较常用的操作步骤，如上文所提到的玻璃珠研磨机法（球磨机法，beadmilling) 和玻璃珠勻浆法 (beadhomogenization), 玻璃珠研磨机法可以在实验室内利用简单的像电磁搅拌器、涡旋混合器或搅拌器来进行操作，也可以采用市售的专用的高速研磨机、振荡器和搅拌器来完成。细胞裂解程度与细胞浓度、珠子的直径和材料、珠子在悬液中所占的比例、处理时间和所受到的作用力相关 (Ramananetal.，2008)。这种方法对于一些很难裂解的细胞，如酵母菌、孢子、微藻类 (microalgae) 效率很高，已经成功应用于细菌、植物、动物细胞的裂解，也在大规模真菌的裂解中被优先采用 (Hopkins，1991)。已经有人对球磨机方法的过程和原理进行了综述 (Harrison,1991;Middelberg,1995)。一般来说，细胞通过与研磨剂及反应池本身相接触被挤压，研磨、产生的剪切力使细胞被裂解。

机械法裂解细胞技术所需的专用机器经历了功能上的革新，出现了很多新的设备。

大多数机械法不易于应用在 5 mL 或更少的培养基所回收的细胞的处理，而且过度的产热和氧化作用也是机械法裂解细胞所常见的问题。虽然在某些案例中，纯化过程中所残留的去垢剂可能会对蛋白质的生物化学性质或晶体学性质产生干扰，但是 96 孔板和其他型号微孔板专用的多头超声探头（96-wellsonicatorheadandmicroplatehorn) 已经得到了应用（Misonix，Inc.Farmingdale，NY;www.misonix.com)。这种物理的高通量的细胞裂解方法是行之有效的。SonicMan 高通量超声系统（MatriCal，Inc.Spokane，WA;www.matrical.com) 是分为％ 孔、兇 4 孔或 1536 孔的单独或组合的系统单元。该系统采用触屏控制，并采用了一次性垫圈销盖 (disposablegasketedpinlid) 来防止孔和孔之间的交叉污染，还有微孔板滑道可以使其直接进入到自动操作站内。其他新的超声仪，如 BioSpec 的产品是无线的手持 Sonozap 超声波勻浆机。1/8 英寸直径的自动调谐探头应用在 0.3~5 mL 小量样品上是很理想的。PressureBioscience(www.pressurebiosciences.com) 公司研究出了台式（benchtop) 的 Barocycler、手持的 PCTShredder 样品制备系统。这些设备能够在专用的 PULSE 管中形成快速、高压力 (最高可达 35kpsi) 环流。这种 1.2~I.5 mL 的管内带有冲压的 (ram) 有孔的圆盘 (lysisdisk)，这些圆盘使流体产生很高的压力，从而很容易就能裂解植物、动物、昆虫和微生物的细胞（Garrettetal_，2002)。FastPrep(快速核酸提取仪）（MPBiomedicals，Irvine，CA;www.mpbio,com)、Geno/Grinder(SPEXCertiprep，Inc.，Metuchen，NJ;www.spexcsp.com)、Mag-NALyser(RocheDiagnostics，Penzberg,Germanywww.roche.com)、Mikro-Dismem-brator(SartoriusStedimBiotech,Aubagne,France；www.sartorius-stedim.com)^MiniBeadBeaterCBioSpecProducts,Bartlesville,OK；http：//www.biospec.com)RetschMixerMill(RetschGmbH,Haan,Germany;www.retsch.com) 等产品包含了处理几毫升体积样品的所有类型的球磨机。这些设备不具有真正意义上的高通量，但是能够高效地处理 1~5 mL 体系中的极不易裂解 (recalcitrant) 的细胞。

微流体匀裝机（microfluidicsmicrofluidizer)(Newton,MA;www.microfluidicscorp.com) 不同于其他类型的高压勻浆机。这种设备通过气压泵作用使细胞悬液通过固定几何形状的微孔道，从而使之加压、加速及分流。之后当离开装置出口时两股高速运动的流体直接相互碰撞产生高剪切力和压差以裂解细胞。微流体勻浆机型号从适合实验室用的能够处理 25 mL 小量样品的 M-110P，到生物制药工业规模的、处理量达到 900L/h, 具有完整的过程控制监控器，支持 CIP 的 M-700, 这一系统已经在 21CFR 和环鸟苷酸 (cGMP) 等产品上得到了验证。ConstantSystemsLtd.(LowMarchDaventry，Northants，England;www.constantsystems.com) 设计了液压传动的裂解设备，这种设备的功能类似于原始的弗氏细胞压碎器，通过施加歧化力（disruptiveforce) 使物料在压力作用下挤出，但不同的是其参数可调，裂解过程可以控制, 并且具有很好的重现性。ConstantSystems 的设备系列从单次上样（每次 1~20 mL) 工作台到连续处理 (405~565 mL/min) 模式均可提供，包括触屏监测和控制、冷却夹套和在位清洗/在位灭菌 (CIP/SIP) 等功能。Avestin，Inc.(www.avestin.com) 提供的 EmulsiFlex 高压匀浆机处理量为 I.0~

1000L/h。这种匀浆机采用气栗或电动活塞泵, 产生的裂解压力为 500~30000psi。这些设备都配有为细胞提取物降温的热交换设备，并且能够进行 SIP 在位灭菌以符合生产企业的药品生产质量管理规范 (GMP) 要求。Glas-Col，LLC(TerreHaute，IN;www.

glascol.com) 公司的 BioNeb 细胞裂解系统采用 10~250psi 的压力进行气压喷雾以裂解 (breakopen) 细胞, 这种方法的好处是不会产热。雾化孔道里的层流产生使细胞裂解的剪切力，这种力的大小与所采用的压力、气体的类型 (氩气<氮气<氦气) 和流体的黏度等因素相关。雾化后的液滴越小，物料黏度越高，采用的气压越高，所产生的剪切力越大 (Surzyckietal.,1996)。

三、结束语

如果能够根据细胞的类型和规模进行适当的调整，本章中所介绍的细胞裂解的方式、试剂和设备都是可用且高效的。但一定有人会问: 在具体的某一项应用中，哪种方法才是最佳的？针对这个问题，已经有人对细胞的裂解方式与所得到的提取物中的蛋白质含量之间的关系进行了研究 (BenovandAl-Ibraheem，2002;DeMeyetal.，2008;Guerlavaetal.，1998;HoetaL，2008)。高压勻浆机和球磨机等物理方法对于大规模的裂解来说是最佳的方法，因为这类方法效率高、成本低，能够快速地对不同体积的物料进行处理。

超声法、化学试剂法 (包括去垢剂、酶法处理)、冻融法及酶法与化学法或物理法相结合的裂解方法也是非常高效的，在实验室里经常用到，尤其是小体积情况下。每种蛋白质的独特性和不同的宿主细胞结构的差别，使细胞裂解和提取物制备技术的选择及优化很大程度上是依赖于经验的。然而，总是可以找到能够成功地提取和制备生物制品的工具及方法，并且这些方法总是与现代的结构和功能蛋白质组学的需求同步发展的。