下文所述的以细胞提取物的产品质量为出发点的各种策略和指导方针适用于大多数下游纯化及分析过程。尽管介绍的重点是在小规模或较大的实验室规模的大肠杆菌裂解上，但是一些技术还是可以用于其他来源的细胞裂解和细胞内蛋白质提取，并且是可以放大的。广泛的蛋白质纯化方面的文献为这里列出的一些蛋白质提取物制备方针及蛋白质纯化和鉴定提供了补充信息 (Burgess,1987;Deutscher,1990;HarrisandAngal，1989;Hopkins，1991;Marshaketal.，1996;Scopes，1994)。
细胞裂解缓冲液的成分和体积不仅对细胞的有效裂解至关重要，而且还将影响随后的纯化过程及目标蛋白质从细胞中释放出来后的稳定性和回收率。每种提取的蛋白质都是独特的，理论上应该有一种与其自身的生化性质和预期的纯化流程都相适应的提取及纯化的缓冲液存在。在大多数的案例中，如果几个基本条件符合了, 多数的普通提取缓冲液都能取得很好的结果。这些基本条件包括 pH、离子强度、防止降解和改善稳定性的添加剂、缓冲液与细胞的比例等。一个对于通过缓冲液成分和其他方法保持酶活性的非常好的参考资料是 Scopes(1994) 的蛋白质纯化 (ProteinPurification)。pH 和缓冲液的技术信息都能够通过 Dawson 等 (1986) 找到，其中包括制备 pH1~13 的缓冲液的表格、缓冲液性质和盐的影响、温度、稀释度。
提取缓冲液的
pH 选择应该在蛋白质等电点之上或之下至少一个单位。这种不同于 Pl 的 pH
能够通过保持蛋白质表面的正电荷或负电荷来防止等电沉淀，还有利于离子交换作为纯化的一个步骤。为了保持缓冲能力和最小电导率的增加，缓冲液的离子强度应该为
20~50 mmol/L，所采用缓冲盐类的 pKa 在所采用的 pH0.5 单位以内。典型细胞细胞质的离子强度为 150~200
mmol/L，这其中含有很高浓度的与离子化蛋白质相互作用的带电荷的生物活性分子。裂解缓冲液至少应含有 50~100_ol/L 的
NaCl。提高裂解缓冲液的离子强度将会降低这些离子的相互作用力，并且减少带电粒子的沉淀。这些沉淀会吸附蛋白质，虽可以通过离心或过滤的步骤去除但因此会造成目标蛋白质的损失。最后，缓冲液中应添加可以防止蛋白质降解、提高蛋白质稳定性的物质作为必需的成分。这包括蛋白酶抑制剂
(表 18.2)、还原剂 [如二硫苏糖醇 (dithiothreitol，DTT)]、磷酸三 (P-氯乙基）醋
[tris(2-carboxyethyl)phosphine，TCEP]、三（3-轻基丙基）膦
[tris(hydroxyprophl)phosphine，THP]、二价阳离子、辅因子、kosmotropes(如甘油、山梨醇或海藻糖)。水溶的无气味磷化氢类的
TCEP 和 THP 都非常稳定，并且比大多数通常使用的硫氢基还原剂/9■巯基乙醇 (浐 mercaptoethanol) 和 DTT
等对保持还原状态的二硫键更加有效
(Clineetal.，2004;Getzetal.，1999;HanandHan,1994)。可以添加非离子的和两性的去垢剂以增加疏水性蛋白质的溶解度。还原剂、蛋白酶抑制剂和去垢剂会干扰一些纯化过程及检验检测分析方法的结果。在选用缓冲液中所采用的化学制剂和其浓度时，这些成分的潜在干扰必须要考虑。对于大肠杆菌细胞裂解所采用的万金油缓冲液
B(bufferB) 为:50 mmol/LTris-HCl 或者是憐酸钠 pH7.5~8,0、50 mmol/L NaCl、5%
甘油、0.5 mmol/LEDTA 和 0.5 mmol/LDTT。推荐采用酵母的裂解缓冲液 (bufferY) 和昆虫细胞的裂解缓冲液
(bufferI) 的配方在下文中会给出。
为了有效地裂解菌体，并保证通过离心和过滤去除不溶的细胞组分沉淀物质后的提取液的回收效率，用来重悬细胞的缓冲液的体积至少要达到原始细胞体积的 3 倍以上。
因为不溶物会吸附约自身体积 50% 的液体，所以至少采用 3 倍体积的缓冲液才能保证最高 85% 的液体回收率。蛋白质在髙浓度下更加稳定，但是高浓度的提取液难以操作，并且会发生蛋白质聚集。尽管裂解缓冲液与细胞体积的比例为 3:1 可以得到浓度更高的提取液, 但是 5~10 倍体积的缓冲液是更加优先选择的，而且能够得到更多的可溶性的蛋白质和更低的提取物黏度。
注意: 在这些缓冲液中，蛋白酶抑制剂可以添加也可以被省略 (表 18.2)，这要看目标蛋白质对蛋白酶水解的敏感性，以及所需要的抑制剂的量和种类。如果起始的蛋白质分离步骤是离子交换色谱法，那么缓冲液 I 和缓冲液 Y 的离子强度可以降低或者提取完毕后再进行稀释。
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