实验材料 转型菌株pQG11 M15 [pREP] 单一菌落
试剂、试剂盒 LB amp kan液体培养基IPTGNa3PO4·12H2ONaClEDTATriton X-100液氮
仪器、耗材 恒温震荡培养箱高速冷冻离心机离心管冰筒
实验步骤
一、仪器用具
恒温震荡培养箱37℃;高速冷冻离心机及离心管 (使用20,000 rpm离心陀)使用高速离心机要注意: 离心机及离心陀的温度要预冷完全,相对位置的两只离心管要平衡好,离心陀转速绝对不能超过最高速限;液态氮及冰筒;37℃温水浴。
二、药品试剂
转型菌株pQG11/M15 [pREP] 单一菌落;LB/amp/kan 及IPTG (1 M stock);Lysis buffer (50 mM Na3PO4·12H2O, pH7.0; 0.1 M NaCl;0.1 mM EDTA; 0.2%Triton X-100)使用前添加成10 mM β-mercaptoethanol,25 μg/mL PMSF,40 μg/mL lysozyme.Buffer A-0 (50 mM Na3PO4, pH7.0) 使用前每1 L 添加70 μL β-mercaptoethanol 成为10 mM 最终浓度。Buffer A-150: Buffer A-0 再加有0.15 M NaCl;硫酸铵(要烘干并以研砵磨碎)。
三、方法步骤
1. 挑取培养皿上单一菌落,培养在15 mL 的LB/amp/kan 液体培养基中,以120 rpm 转速震荡,在37℃下培养过夜。
2. 取上述菌液6 mL加入300 mL新鲜LB/amp/kan培养基中,以120 rpm 37℃培养至A600 = 0.6 后,加入IPTG成为1 mM浓度,继续以120 rpm在37℃震荡培养4 h。