在评价样品纯度之前，首先需要鉴定待测杂质的类型，如核酸、碳水化合物、脂质、无关蛋白质、同工酶类、失活蛋白质，进而确定在特定溶液条件中, 能够区分假定杂质和目标蛋白质的理化特性 (化学分析或物理特征）。而纯度则是指待测杂质含量低于某个特定水平。需要注意的是，上述说明中并没有要求描述杂质的性质。纯化过程可能已将某一杂质的浓度降低到检测下限以下，但色谱峰中还有残留。毫无疑问，表观纯度取决于所选择的测定方法及其灵敏度。由于大多数分离方法都能够有效地去除非蛋白质类杂质，因此本章节将主要介绍蛋白质样品中蛋白质类杂质的检测方法。有关核酸、脂类、碳水化合物杂质的检测方法在本系列其他卷中有所介绍。
随着蛋白质类生物制品的流行, 蛋白质纯度已经成为药品管理的重大问题。人用药品注册技术要求国际协调会 (TheInternationalConferenceonHarmonisation,ICH) 关于生物制品的质量指导原则（ICHQ6B，1998) 中考虑到了原料药（基体材料，bulksubstance) 和药物产品 (药物剂型或成品）中的杂质成分, 并认可了生物分子（如蛋白质）的固有异质性 (inherentheterogeneity)。指导原则中阐明：「除了评价原料药和药物产品的纯度可能由预期产品和多种产品相关物质组成——之外，制造商还应评价可能出现的杂质成分。这些杂质可能是过程相关或者产品相关, 它们可能是结构已知的、部分定性的，抑或是未经鉴定的。」该指导原则进一步区分了过程相关的杂质（由生产过程产生，包括宿主细胞蛋白质、宿主细胞 DNA、细胞培养诱导物、抗生素以及其他下游生产过程产生的杂质) 和产品相关杂质，包括生产或储存过程产生的分子变异体（molecularvariant), 这些分子变异体在活性、有效性和安全性等特性上都无法达到预期产品的效果。」该指导原则认可了上述的分析能力。例如，有关原料药指导原则中提到「生物工程制品和生物制品的绝对纯度很难测定，结果往往依赖于所选择的测量方法……因此，通常将多种方法结合来评价原料药的纯度。选择和优化分析过程，应该着重考虑目的产品与产品相关物质以及与杂质的分离。」有关药物产品的讨论类似于原料药，但是还介绍了产品降解以及由于辅料 (excipient) 干扰而造成的产品相关杂质的测定方法。
目前有一些高灵敏度的方法可用于检测样品中的杂质 (表 38.1)。其中每种方法测定分子的一种特定物理特性。方法的选择依赖于以下标准:①可用于检测的蛋白质的量；②待测杂质的性质;③所需的检测精度;④所需的检测灵敏度;⑤可能干扰到该方法的蛋白质及其溶剂特性。最为简单和常用的方法是，经一次或多次分离后证实只有一种组分可被检测到。若纯度标准为只可以存在一种可检测物质，则需用多种分离手段检测杂质。
当所选择的某种检测方法无法从主要分析物中分辨出一种未知杂质时，推荐使用正交的方法 (orthogonal)。最后，谨慎处理样品非常重要，这样可以防止在制备分析所用的样品过程中改变其杂质谱。并且，洁净的环境、适宜的温度及适当材质的容器都会为分析提供帮助。
很多合适的方法已经在本卷中的其他地方详细介绍，这里不再赘述。有一些分子质量或分子大小的检测方法在本卷其他章节也有概述，因此在本章的讨论中，有时会引用/参考相关章节的细节 (Rhodesetal.,2009)。本章的重点将放在介绍更适用于检测杂质而不是定量测定大小、质量等其他分子参数的方法上。此外，本章还概述了方法选择的原则, 一些方法的局限和优势, 并描述了一些不涉及分离的纯度测定方法。
一些方法能够量化氨基酸、特定辅基团或活性位点的摩尔数，可以用来评价蛋白质样品的纯度。如果已知纯蛋白质的活性，那么单位活性测量可以用来检测相对纯度。这些方法是间接的，因为总要将分析物假设为不含杂质的纯品，并将该假设纯品的量作为参照。这些方法主要适用于纯化过程早期的多相系统，或适用于需要特殊环境来保持活性的分子 (如膜蛋白）。一般需要检测两项: 第一项是分析所用样品中蛋白质 (或原料）的总量; 第二项是定量已知的活性对象或其他特殊的分析对象。然后根据蛋白质的总量，计算出相应的预期分析对象的量。纯度则以分析对象的测定量和预期量的比值表示。使用末端基团分析法（Chang,1983)、特殊辅助基团定量分析法和酶活定量分析法（Biggs，1976) 等都可以非常好的量化纯度。本方法的详细信息 Rhodes 等（2009) 在本书中有介绍。
蛋白质的组成和活性分析仅能说明是否有杂质存在，通常很少能提供有关杂质的性质信息 (如大小和电荷）。除非杂质干扰到测定过程或蛋白质活性，活性检测可能无法提供有关杂质的任何信息。因此，实验者无法得到足够线索以去除杂质。
电泳法提供了最简单、成本最低，并且在确定样品中蛋白质组分数目方面灵敏度最高的手段，因此最为常用。由于成本极低且相当简单，这些方法常被用做蛋白质纯度第一步筛选，甚至应用于初期高异质性的样品。本书中其他章节介绍了 SDS 凝胶电泳以及利用电泳测定分子质量和大小的方法 (Rhodesetal.,2009)。这些方法都可以单独测定样品的纯度，方法的选择取决于希望检测待测蛋白质的何种性质 (表 38.1)。如果预期杂质与目标蛋白质分子质量有差距，SDS 凝胶电泳可以分辨出杂质。对于分子质量相近但氨基酸组成不同的分子，SDS 凝胶电泳一般不能区分，但是在非变性凝胶电泳中它们有不同的电泳迁移率。另外，几乎任何大小的蛋白质都可以通过等电聚焦法分离。有关等电聚焦法在本书的其他章节中有所介绍 (Friedman,2009), 这里不做详述。
根据采用的电泳检测方法的类型, 所需样品量从纳克级到微克级。由于每种杂质在特定样品中占据固定的质量分数 (weightfraction)，而杂质的检测依赖于其总量，因此上样量过载的胶也许能够更有机会检测到某种杂质。然而，样品上样量的上限取决于样品溶解度，并且需要基于分辨率的考虑 (Lunneyetal.，1971)。一般后者的限制性更强，因为样品浓度较高或者大体积样品量会导致谱带扩张和变形。由于过载造成的谱带扩张将难以分辨具有相似电泳迁移率的杂质。然而，电泳这种最灵敏的谱带检测方法 (需要的样品量最小) 不适于回收样品。如果蛋白质样品已变性或者已在极端条件下溶解，一般很难再回收活性蛋白质。如果使用的是非变性电泳，则可通过电泳提取（electirophoreticextraction) 从凝胶中回收样品（Friedman,2009;Garfin,2009)。但是变性电泳可能无法回收天然蛋白质 [例外请参见 Burgess,(2009)]。复性成功与否很大程度上取决于蛋白质的结构。较大或多亚基的蛋白质恢复天然构象的可能性比小单体蛋白质要小。
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