以下是离子交换层析柱操作的一般性步骤。此外还需要一些专用步骤以确保离子交换剂在使用时保持稳定。这些步骤如下：’
(1) 加载盐溶液；
(2) 平衡层析柱；
(3) 蛋白质上样；
(4) 洗去未结合物质；
(5) 洗脱；
(6) 再生；
(7) 消毒处理。
一般操作条件如表 22.2 所 TK。
因为平街离子必须要彻底地饱和带电荷的配基, 所以, 盐溶液的加载是至关重要的。
本步骤通常采用含有 1mol/LNaCU 物质的量浓度为 10~100 mmol/L 的缓冲液进行。
很少使用 KCl。二价离子应避免使用。加载缓冲液的体积应至少为 1 个柱体积，以确保层析柱饱和。需要在线或离线监测电导率方可进一步进行优化。
平衡层析柱时，采用的缓冲液应适宜于蛋白质结合。依据具体情况确定缓冲液的类型、pH 及盐浓度。本章结合条件部分中已经陈述了关于适宜缓冲液的粗略选择。平衡过程应至少需要 10 个柱体积缓冲液。采用较大体积的缓冲液是为了获得更稳定的 pH 环境。因为不同的离子经过层析柱的移动是不一样的，所以与相同电荷的离子相比, 相反电荷的离子更可能保持不动。这样，不同的离子便可以依次流过层析柱。为维持中性电荷，pH 要随之发生改变。该现象的详细解释可参见 Pabst 和 Carta(2007) 的报道。尤其是对于弱离子交换配体，相应地需要更大体积的平衡缓冲液才能达到实际所需的 pH 环境。
蛋白质溶液上样时，应采用与平衡缓冲液一致的 PH 和电导率。通常情况下，不太可能达到该条件，尤其是当初始原料中的离子组成与缓冲液完全不同时，所以在上样的过程中会发生 pH 转变。当采用分子筛层析、透析或渗滤对蛋白质溶液脱盐后，可以达到与缓冲液相同的离子组成，进而获得相对最稳定的上样条件。
完成蛋白质溶液上样后，冲洗掉未结合物质。通常首先尝试平衡缓冲液。为了在洗脱中获得的目标蛋白质纯度更高，可以采用多步的清洗程序。例如，对于结合紧密的目标蛋白质，可用稍高盐浓度的平衡缓冲液冲洗。可以向冲洗缓冲液中加入某些化合物，而所加人的这些化合物似乎很具有蛋白质特异性。目前，已有多种方案采用了在冲洗缓冲液中加人某些物质, 它们均具有一定的蛋白质特异性。这些物质可以是尿素、糖类和乙二醇等。
洗脱会受到线性或分步盐梯度或置换展开的影响。一般最好先采用线性的盐梯度洗脱，维持梯度约 10 个柱体积。在最简单的情况下，梯度操作需两种缓冲液，平衡缓冲液 (bufferA) 和用于加载相反电荷离子所用缓冲液 (bufferB)。大多数情况下，并不需要后半段的梯度，因为多数蛋白质都可以在 150?500nmolI 盐浓度下从传统的离子交换剂上洗脱下来。所以，通常最大梯度达到 50%B 足矣。分步洗脱也可通过 bufferA 和 bufferB 实现。也应该意识到也许永远都不会获得一种理想的适用于层析柱的分步洗脱。首先，盐滞留以及 HPLC 的盲端体积都是决定取样时间的因素; 其次, 因为缓冲液混合器的特性，仅能获得 S 形曲线 (KaltenbrunnerandJungbauer，1997)。根据分步洗脱中选择的盐浓度，蛋白质会随着盐峰前端移动或移至盐峰前端的后方。Yamamoto 等 (1088) 将其命名为 I 型或 n 型洗脱。当浓缩的洗脱物被冲洗出来后，所选择的盐浓度必须适于 I 型洗脱。此时的盐浓度可能要比相应采用线性梯度洗脱所达到的最大盐浓度高一些。I 型洗脱所需的缓冲液小于 1 个柱体积。
PH 梯度洗脱更难于优化。所以，最好首先根据蛋白质的 pi 找到一种条件—此时蛋白质不与离子交换剂结合。若低于 PI，宜采用阴离子交换剂; 若高于 pi, 宜采用阳离子交换剂。因此必须降低或提高 pH。请记住，离子交换剂本身相当于一种酸或碱，生成 pH 梯度应遵循滴定曲线。要获得线性的 pH 梯度是十分困难的, 但是采用含有二元醇的硼酸盐缓冲液可以实现，如甘露醇 (Kaltenbrunneretal.，1993)。第 4 种洗脱方式就是采用手动调节的 pH 梯度进行洗脱。当采用 10 mmol/L 的较低浓度缓冲液洗脱时, 使用盐可以导致 pH 梯度，这种梯度的形成是因为不同种类盐移动情况不同。这种手动调节的 pH 梯度，可以用于髙分辨率，另外也有利于蛋白质峰集中（Pabstetal.，2008a;2008b)。这种情况下, 也需要数个柱体积的缓冲液。
对于层析柱的再生，最佳的条件是使用与最初加载盐溶液相同的缓冲液。这种情况仅在处理相对清洁的原料时才可能出现。可以将两个步骤合并为一个步骤。尤其是当脂类、内毒素和其他黏性物质承载于离子交换柱时，推荐使用具有腐蚀性的试剂进行再生，优选 Imol/LNaOH。NaOH 的最大使用浓度取决于固定相的耐受性，一般使用 1 个柱体积的量已经足够，但是对于非常顽固的杂质，应将层析柱浸于 NaOH 溶液中。可将 1 个柱体积 NaOH 泵人层析柱后，停止流动，使 NaOH 滞留于层析柱中数小时。
NaOH 处理同样起消毒作用。它确实可以减少层析柱中的细菌数量，但不是对层析柱灭菌。要将层析柱进行灭菌处理是十分困难的 (_1111 培匕&此 1&：1(11^1:1；1161：，1994;〗1111§-baueretal.，1994)。装好的层析柱中存在非常多的盲端孔，灭菌剂只能通过扩散至这些孔内。氧化剂通常与固定相以及设备不相容。对于较小的层析柱，可以采用高压蒸汽灭菌，并可在无菌条件下连接于系统。一般不必对层析柱进行灭菌处理。
层析柱需要用再生缓冲液仔细洗净后才能储存, 必要时还要进行灭菌处理，储存时用相反电荷离子将层析柱完全饱和。层析柱饱和后，可采用缓冲液进行清洗和储存，如 20% 的乙醇。实验室使用时, 推荐向储存溶液中加人相关的杀菌剂, 通常采用 NaN3。
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