实验材料 cDNA

试剂、试剂盒 BHI氯霉素NaOHSSC氯仿异戊醇TESSDSmRNA甲硫氨酸乙醇乙酸钠免疫沉淀缓冲液

仪器、耗材 转子硝酸纤维滤膜离心管微量多孔洗涤仪

实验步骤

1.  往微量滴定板的每孔中加入250 μl 含适当抗生素的选择性BHI培养液，并分别接种独立的cDNA克隆，37℃温育过夜。

2.  在250 ml 烧瓶中加入50 ml BHI/抗生素培养液，以10个克隆过夜培养液为一组， 从每个微孔中取100 μl 培养液，混合后接种到烧瓶中。

3.  37℃培养至A590=0.7，然后加入氯霉素继续于37℃温育过夜；对每组10个过夜的克隆重复培养。

4.  2 000 g  4℃离心10 min，制备质粒DNA。

5.  将制得的约50 μg 质粒DNA溶于1.5 ml TE缓冲液中，移入15 ml无菌、带盖的玻璃培养管中。

6.  沸水浴10 min立即加入1.5 ml 1 mol/l NaOH，室温放置10 min。

7.  加 9 ml 中和液，混匀后置于冰浴，检测pH只值应在6.5~7.5之间。

8.  将0.45 μm 孔径的硝酸纤维素滤膜放在一个连于真空泵的多孔滤器上。

9.  以1 ml/min 的速率加入第4步得到的变性DNA液，待所有液体被吸干后继续抽吸3 min。

10.  取出滤膜用50 ml 6×SSC洗涤，然后于80℃真空烤箱中烤膜2 h。

11.  用无菌的单孔打孔器在滤膜上打出直径为5 mm 的圆形小块滤膜，分别用圆珠笔作好标记。

12.  将盛于无菌带盖的塑料管的含10~50 μg poly（A）+ RNA的0.3 ml 杂交液在70℃预热10 min。

13.  然后将10片小滤膜放入杂交液中，在50℃温育2 h。

14.  将小滤膜转移到50 ml 的试管（每管最多可装20片膜）中，每次用225 ml TES/0.5%SDS冼液于65℃旋转振荡洗涤30 s，共10次，吸去上请。

15.  然后每次用25 ml TES液干65℃洗膜，共2次。

16.  将每片小滤膜分别转移到无菌、硅化的1.5 ml 微量离心管中，每管加入0.3 ml 水、2 μl 10 mg/ml 的酵母tRNA。

17.  置沸水浴中变性60 s，立即置干冰或冷乙醇中速冻。 接着在室温下解冻。

18.  用无菌针挑去滤膜，往每个微量离心管中加入150 μl 饱和酚和150 氯仿/异戊醇，混匀，离心后将水相转移至无菌的微量离心管中。

19.  加入30 μl 3 mol/l 乙酸钠和2 倍体积的无水乙醇，离心沉淀核酸15 min，用0.5 ml 乙醇洗涤一次后冻干。

20.  将此杂交选择的RNA重悬于10 μl 水中。

21.  取5 μl 杂交选择的RNA，加入10 μl 翻译反应混合物，其中含标记的甲硫氨酸， 30℃温育60 min。

22.  加入15 μl 免疫沉淀缓冲液和1 μl 未经免疫的血清，室温下温育10 min。

23.  加入40 μl 蛋白质A-Sepharose悬液，在室温静置30 min、离心2 min 后将上清移至另一个新的微量离心管中。

24.  加入1 μl 针对相关基因产物的多克隆抗体或单克隆抗体，于室温下温育10 min。

25.  加入40 μl 蛋白质悬液，于室温反应30 min，离心弃上滑。

26.  依次用1 ml 免疫沉淀缓冲液、1 ml 高盐免疫沉淀缓冲液和1 ml 水冼涤蛋白A-Sepharose微珠。

27.  用20 μl 2×SDS样品缓冲液重悬沉淀，沸水浴10  min。

28.  将吸附在蛋白A-Sepharose微珠上的翻译产物洗下来，离心后等分成15~20 ml 的小份进行变性SDS-PAGE电泳。

29.  干胶并进行放射自显影曝光。