实验方法原理

蛋白质在十二烷基硫酸钠（SDS）和巯基乙醇的作用下，分子中的二硫键还原，氢键等打开，形成按1.4 g SDS/1 g蛋白质比例的SDS-蛋白质多肽复合物，该复合物带负电，故可在聚丙烯酰胺凝胶电泳中向正极迁移，且主要由于凝胶的分子筛作用，迁移速率与蛋白质的分子量大小有关，因此可以浓缩和分离蛋白质多肽。

聚丙烯酰凝胶电泳分离蛋白质多数采用一种不连续的缓冲系统，主要分为较低浓度的成层胶和较高浓度的分离胶，配制凝胶的缓冲液，其pH值和离子强度也相应不同，故电泳时，样品中的SDS-多肽复合物沿移动的界面移动，在分离胶表面形成了一个极薄的层面，大大浓缩了样品的体积，即SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓缩效应。

实验材料 蛋白质样品

试剂、试剂盒 丙烯酰胺甲叉-双丙烯酰胺蒸馏水SDS 过硫酸胺TEMEDTris甘氨酸Tris-HClDTT溴酚兰甘油正丁醇

仪器、耗材 移液器移液管烧杯垂直电泳槽电泳仪

实验步骤

一、试剂

1.  30%凝胶贮备液：称取29 g 丙烯酰胺（Acr）和1 g 甲叉-双丙烯酰胺（Bis），加蒸馏水至100 ml，滤纸过滤贮存。

2.  10% SDS：称取SDS 10 g 加蒸馏水至100 ml。

3.  10%过硫酸胺（AP）

4.  N，N，N’，N’四甲基乙二胺（TEMED）

5.  5×电泳缓冲液：于900 ml蒸馏水中分别加入15.1 g Tris、94 g甘氨酸、5 g SDS，混匀后加蒸馏水至1 000 ml。

6.  1.5 mol/L Tris-HCl(pH8.8)和1.0 mol/L Tris-HCl(pH6.8)

7.  电泳加样缓冲液

10 mmol/LpH6.8 Tris

200 mmol/LDTT

4%SDS

0.2% 溴酚兰

20% 甘油

8.  正丁醇

二、器材

移液器、移液管、烧杯、垂直电泳槽、电泳仪。

三、操作步骤

1.  配制分离胶浓度8%、体积15 ml

H2O ：6.9 ml

30%凝胶贮备液 ：4.0 ml

1.5mol/L Tris-HCl(pH8.8) ：3.8 ml

10%SDS： 0.15 ml

10%过硫酸胺： 0.15 ml

TEMED： 0.01 ml

2.一旦加入TEMED，混匀后立即小心地将分离胶注入准备好的玻璃板间隙中，为成层胶留有足够空间。用毛细管轻轻在其顶层加入几毫升正丁醇，以阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用。

3.  聚合完成之后，倒掉覆盖液体，用去离子水洗凝胶上部数次，尽可能用吸水纸吸干顶端的残存液体。

4.  配制5%成层胶5 ml，插入梳子，小心避免混入气泡，垂直放置室温下。

H2O ：3.4 ml

30%凝胶贮备液： 0.83 ml

1.0 mol/Ltris-HCl(pH6.8) ：0.63 ml

10%SDS ：0.05 ml

10%过硫酸胺： 0.05 ml

TEMED ：0.01 ml

5.  在成层胶聚合时，将样品与加样缓冲液混匀，100℃加热3 min。

6.  成层胶聚合完成后，用去离子水冲洗梳孔以除去未聚合的丙烯酰胺，将凝胶放入电泳槽上。

7.  加样。

8.  电泳：开始时电压为8 V/cm凝胶，染料进入分离胶后，将电压增加到15V/cm凝胶，继续电泳直到染料抵达分离胶底部，断开电源。

9.取下凝胶，固定、染色或进行分析。