肿瘤的发生、发展以及转移与糖链的表达密切相关。一些肿瘤细胞糖基化修饰的改变能够影响细胞的周期调控和细胞的增殖能力，促进肿瘤的发展，但具体分子机制尚不清晰。来自美国纽约大学医学院的科研小组借助糖基化研究新工具——凝集素芯片，发现肿瘤转移相关驱动因子，进而找到其上游调控因子以及下游靶向因子，揭开了黑色素瘤转移机制，相关结果发表在国际顶级学术期刊Cancer cell上（PMID: 28609658）。
技术背景——凝集素芯片介绍
凝集素（Lectin）是一类自然界广泛存在的蛋白质，具有特定糖结构识别的特性。利用凝集素进行特定糖结构的解析是糖生物学研究领域的常用手段。凝集素芯片是将多种经典凝集素以微阵列的形式固定在高分子三维芯片片基上，形成高通量凝集素芯片，可进行多种糖结构的同步筛选和交叉验证。
1、凝集素芯片筛选糖基化谱
首先，研究人员通过凝集素芯片对临床黑色素瘤样本进行差异糖蛋白筛选。重点分析黑色素瘤原发灶和转移灶中糖基化差异，找到了发生显著变化的四种糖基化修饰（绿色方框表示该糖基化在原发灶中高表达，转移灶中低表达；红色方框表示该糖基化在原发灶中低表达，转移灶中高表达。同时，研究人员从TCGA、GEO数据库中提取获得相对应的糖基化基因的表达水平数据，见图1。（PS: TCGA (The cancer genome atlas)是目前重要的癌症基因信息数据库，其主要收录各种人类癌症的临床数据，基因组变异，mRNA表达，miRNA表达，甲基化等数据，是癌症研究者很重要的数据来源。GEO数据库（Gene Expression Omnibus)是NCBI的基因表达数据库，也是当今比较全面的公共基因表达数据资源。）
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图1 黑色素瘤原发灶和转移灶中糖基化检测与糖基因表达水平分析
2、体外实验：糖基化基因功能验证
随后，科研人员在黑色素瘤细胞系中，应用siRNA技术对先前筛到的差异糖基化基因进行功能验证。细胞侵袭实验结果证实FUT1、FUT2的沉默促进肿瘤转移，而抑制FUT8后，肿瘤转移明显下降。免疫荧光和免疫组化结果显示：转移灶中凝集素LCH等识别的N核心岩藻糖基化（糖基化基因为FUT8）表达明显升高，而凝集素UEA-I等识别的α-1,2岩藻糖基化（糖基化基因为FUT1/ FUT2）表达显著降低，见图2。
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图2 体外实验验证糖基化基因功能
3、体外&体内实验：糖基化基因FUT8功能确证
对于药物开发来说，在转移灶中上调的指标FUT8相对更容易作为药物靶点。因此，研究人员后续重点关注FUT8，推测FUT8可能是肿瘤侵袭转移的驱动子。进一步，通过体外和体内实验发现，敲减FUT8，细胞侵袭受到抑制，黑色素瘤体内侵袭能力也有明显下调，证实FUT8的表达与肿瘤转移侵袭密切相关，如图3。
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图3 糖基化基因FUT8功能确证
4、FUT8上下游转移机制研究
研究人员采用Matinspector software转录因子预测软件结合ChIP Enrichment Analysis database找了一系列FUT8上游转录因子，并通过siRNA实验，证实TGIF2作为上游转录因子，调控FUT8的表达，见图4。
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图4 FUT8上游调控因子分析
研究人员选取3株不同的黑色素瘤细胞系，通过核心岩藻糖凝集素pull-down结合MS鉴定，鉴定到三个样本中共同拥有的114种岩藻糖基化修饰的蛋白。进一步进行GO分析，发现一系列与细胞运动迁移相关的蛋白，如L1CAM、NRP2，见图5。
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图5 FUT8下游靶向控因子分析
5. FUT8靶向L1CAM 促进肿瘤转移侵袭
根据前期文献报道，L1CAM与黑色素瘤发展密切相关，因此研究人员推测FUT8可能通过促进L1CAM的岩藻糖基化来促进肿瘤转移。实验结果显示：在过表达L1CAM的肿瘤细胞中敲减FUT8，L1CAM核心岩藻糖基化程度下降，侵袭能力下降；过表达FUT8，敲减L1CAM可以明显抑制肿瘤侵袭。L1CAM的N核心岩藻糖基化可以保护其不被蛋白酶识别剪切，从而促进了肿瘤细胞的转移，如图6。
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图6 FUT8靶向L1CAM促进肿瘤转移侵袭
小结：
在这项研究中，研究人员应用凝集素芯片，找到黑色素瘤转移灶中高表达的4种糖基化修饰类型。进一步根据差异糖基化寻找糖基化差异基因，发现FUT8参与黑色素瘤转移。TGIF2调节FUT8的转录促使在转移灶中的高表达，而FUT8介导L1CAM的N核心岩藻糖基化水平上升，导致plasmin无法识别L1CAM，失去对L1CAM的水解作用，而全长的L1CAM可以促进肿瘤转移，如图7。关于凝集素芯片，我们经常看到的报道都是疾病标志物相关的研究。本文通过凝集素芯片进行深入的肿瘤转移机制研究，说明了糖基化基因可以成为驱动肿瘤侵袭转移的癌基因，为肿瘤及其他疾病深入机理探索提供了新的切入点和研究思路，值得推荐。
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图7 FUT8促进肿瘤转移侵袭模式图
华盈生物作为中国蛋白芯片行业的标杆企业，我们着力打造蛋白芯片全产品线和系统性解决方案。我们提供的凝集素芯片覆盖有55种常见凝集素，能够为疾病机理研究、疾病标志物研究、糖修饰组研究等提供强大技术支撑。
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