随着分子遗传学技术出现，体细胞杂交也取得了重要的进步：作为探针的 DNA 可以从用于体细胞杂交或 Southernblot 的细胞中获取，而来自相应基因的探针无论是杂交到滤膜，还是杂交到染色体的变性或非变性的片段上，都能被辨别。然而，由于人类与啮齿目动物在 DNA 和蛋白质水平上的相似性，作为杂交用的片段必须非常特异，以免与啮齿目动物发生交叉反应。利用这一技术，许多基因被成功定位，但值得注意的是：由于假基因和基因家族的存在，探针在设计时应尽量与该基因的相应片段吻合，以免与这些基因发生交叉反应。

单层全细胞融合实验

实验材料 汇合至一定程度的受体细胞

试剂、试剂盒 受体细胞适合生存的培养基合适的选择性试剂含感兴趣染色体及合适遗传标记的供体细胞

仪器、耗材 10 cm 组织培养板25 cm 组织培养瓶倒置相差显微镜

实验步骤

基本方案 单层全细胞融合

1.倘若不知道细胞的选择条件，通过以下方式来确定：将培养于 25 cm 培养瓶中的受体细胞传代，比例为 10:1，分装于不同培养瓶中，并用不同水平的选择试剂来培养。

每周 2 次观察细胞，换液，10d 之后确定抑制细胞生长的试剂的最低浓度。

2.在融合前的当天下午，将等量的供体细胞和受体细胞（通常为 5X105?IXlO6 个) 培养于含 IOml 有血清的培养基中，同时分别将供体细胞和受体细胞培养于含或不含 PEG 的培养基来做对照，培养过夜。

供体和受体细胞在选择条件下需死亡，含 PEG 的细胞应该在选择条件下恢复并开始汇合，当一个新细胞系或新的 PEG 使用时，后者的对照需重故。

3.在显微镜下观察细胞，其需 70% 汇合，细胞与细胞之间需接触良好，但互不挤压，若细胞量不够，准备新培养瓶增加培养。

4.将瓶中的培养基吸出，用无血清的培基洗 2 次，并完全将其吸出，将瓶倾斜一段时间同时将最后的培养基吸出。

5.加 2 ml50%PEG 溶液，37°C。将培养瓶来回倾斜使溶液在细胞中快速混匀，让其站立 2 min(时间非常重要），若有必要，通过以下试验来优化条件：peg 浓度为 44%~50%; 单层细胞孵育 2~3 min, 悬浮细胞 2~4 min。

6.将 10 ml 无血清培基轻柔地从皿的一边加人，轻柔颠倒使 PEG 扩散完全，吸出培基并弃去，用无血清培养基重复洗两次，最后一次用 10 ml 有血清培养基洗，由于细胞膜此时非常脆弱，故以上操作均需轻柔。

7.加人 10 ml 有血清培养基，孵育 36~48 h(在该时间段内使细胞扩增 2 次）。

8.用胰酶消化细胞，将其分至 5~10 个 10 cm 培养板中。为了确保选择，板中的细胞浓度需低，以保证细胞在汇合之前能分裂几次。在每个板中加入 10 ml 有血清培养基和合适浓度的选择性试剂（第 1 步），在 37°C 中孵育。

9.每 5d 换一次液直至长出克隆，换了选择性培基后 10?14d 后确认皿中是否有克隆长出。避免损坏细胞或使其长得越来越大，因为移动细胞可能使其长出姐妹克隆。

10.用挑克隆的针将克隆挑出（支持方案 1)。

11.为了避免维持和扩增不需要的细胞系，一旦克隆长出，立即扩增、鉴定（第 3~5 步）及冻存（附录 31)。为避免染色体缺失和重组，传代需少（三代以内细胞使用一个冻存管，1 个 6 cm 培养皿使用 2 个冻存管）。在鉴定细胞系时，需使用多种鉴定方法，在复苏和扩增时需重新鉴定以确保无染色体重组和分离。若有必要，对已分离出额外染色体的细胞系挑亚克隆（支持方案 2)12. 在快速复苏时，将细胞培养至 25 cm 组织培养瓶中，若细胞在冻存后恢复较慢，则增加冻存培养基中的血清含量。

备选方案 悬浮培养供体细胞-单层的供体细胞的全细胞融合

1.消化贴壁生长的受体细胞，在培基中重悬，用血细胞计数器对供体细胞和受体细胞计数，分别取 2XIO 6 个，在 15 ml 扣盖的聚丙烯试管中混勻，维持以确保选择有效。

2.室温 400 g 离心 5 min，在受体细胞中加入 IOml 无血清的培基，再次离心，小心吸出培养基，将试管倾斜以吸干培养基。

3.轻弹试管使团块松散。用移液器吸取 0.3 ml 50% PEG 溶液，37°C，沿管壁加人同时轻摇或轻弹试混勻。室温孵育 3 min。如有必要，可以优化融合条件（基本方案，第 5 步）

4.加入 8 ml 无血清培养基，立即 400g 离心 5 min。

5.小心吸出培养基，再用 IOml 无血清培养基重悬细胞。再次离心。室温下，吸出培养基，用 IOml 血清培养基重悬细胞。洗的过程中要格外小心，因为此时细胞的膜很脆弱。

6.加 3 ml 细胞悬液到每个 IOOmm 组织培养板内。加 ImI 细胞悬液到另一 100 mm 培养板内，作为对照。孵育 36~48 h。

7.用加血清和筛选因子的培养基培养细胞（用未加筛选因子作对照）。

8.准备克隆及其鉴定（基本方案，第 9~12 步）