实验方法原理
首先用酶免疫动物制备成效价高、特异性强的抗酶抗体。在特异性抗体与抗酶抗体之间利用第二抗体作「桥梁」，将它们连接起来，再将酶结合在抗酶抗体上，经显色显示抗原的定位。
其基本流程为：抗原+特异性抗体 → 第二抗体（桥抗）→ 抗 HRP 抗体 → HRP → DAB+H2O2（显色）。
因为桥抗体对特异性抗体的量是过剩的，与特异性抗体结合后还剩有抗原结合位点，能与抗酶抗体结合，所以桥抗体能起到连接特异性抗体和抗酶抗体的作用。在此过程中，酶是利用免疫学原理与抗酶抗体结合的，从而避免了由于酶标记抗体而引起的酶和抗体的活性损害，提高了方法的敏感性，降低了非特异性染色。染色原理见图 4-7。
实验材料 石蜡切片动物血清冰冻切片细胞涂片
试剂、试剂盒 胰蛋白酶特异性一抗桥抗体PBSDABH2O2丙酮甲醇抗酶抗体HRP 酶苏木精盐酸乙醇乙醇树胶
仪器、耗材 滴管玻片
实验步骤
1. 石蜡切片脱蜡至水，冰冻切片或细胞涂片经丙酮固定 10 min，PBS 洗 3 min × 3 次。
2. 滴加 0.3% H2O2 甲醇液，室温处理 20 min，PBS 洗 3 min × 3 次（抑内源性过氧化物酶活性）。
3. 0.1% 胰蛋白酶 37°C 消化 20 min 或 AR（只限于石蜡片），PBS 洗 3 min × 3 次。
4. 滴加 1:（5～20）正常羊血清或牛血清 20 min（室温或37℃），吸去多余血清，不洗。
5. 适当稀释的特异性一抗（例如来自种属 A）37℃ 孵育 60 min 或 4℃ 过夜，PBS 洗 3 × 3 min。
6. 第二抗体（也称桥抗体，抗种属 A 的 IgG 抗体）37℃ 孵育 40 min，PBS 洗 3 × 3 min。
7. 抗酶抗体（来自种属 A）37℃ 孵育 40 min，PBS 洗 3 × 3 min。
8. 酶（HRP 70～100 μg/ml，PBS 溶解）37℃ 孵育 40 min，PBS 洗 3 × 3 min。
9. 0.04% DAB + 0.03% H2O2 显色 8～12 min，最好在光镜下控制。
10. 充分水洗，苏木精复染，盐酸乙醇分化 15～30 s。
11. 常规树胶封片，结果观察。
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