3 免疫策略
不同实验室使用的免疫策略是不同的，很多免疫策略都同样有效。 目的是扩大宿主体内抗原反应性 B 细胞的数量。体内每次接触到蛋白质抗原，都会增加抗原反应性B 细胞的数量。在对抗原的再次应答中，产生的抗体量会增加，总的免疫球蛋白类别会从以IgM 为主转变为以IgG 为主，特异性抗体的亲和力增高。总体来说，体内的免疫应答越强 ，靶抗原反应性B 细胞数量越多，那么分离到能够分泌所需结合能力和功能活性的抗体的杂交瘤细胞的概率就越大。体外方法进行免疫激活和B 细胞扩增还没有显示高度的可靠性。诚 然 ，对从免疫动物中分离的脾细胞在体外进行激活得到过很好的结果，这种方法制成的杂交瘤主要分泌IgM 单克隆抗体。
特定抗原的免疫原性受多种因素影响，但使用佐剂（第 3 章）可增强免疫原性。佐剂(来源于拉丁语adjuvare，是「帮助」的意思）作为抗原承载物可以阻止抗原的清除，延长抗原在体内刺激免疫系统的时间，募集细胞到抗原所在的部位，并因其能增强共刺激信号和激活免疫系统而刺激淋巴细胞增殖。前面已经介绍了几种佐剂系统，包括弗氏佐剂，是主要的免疫佐剂，用了几十年。然而，弗氏完全佐剂也可以引起不需要的副作用。因此，作为替代品，合成的油包水型乳化佐剂已被开发出来，可降低毒性（如 R ib i或 TiterMax)。此外，明矶可以和抗原一起形成共沉淀，具有低毒性，已经用于某些疫苗中。在某些情况下 ，使用弗氏佐剂不能产生针对特定表位的有效体液免疫应答，但是使用明矾却可以。最后 ，来源于细菌的基因序列—免 疫 刺 激 性 C pG 寡核苷酸序列（含未甲基化的胞嘧啶和鸟嘌呤二核苷酸）最近被用来增强固有免疫, 诱导树突状细胞、单核细胞和巨噬细胞成熟，引 起 T h l细胞介导的细胞免疫，刺 激 B 细胞增殖和免疫球蛋白合成，导致体内保护性免疫的产生[21』 22]。
典型的免疫策略依赖于抗原的反复刺激，以增强特异性免疫应答并使其成熟。表5.2 列出了 — 典型的免疫接种时间表。在这个例子中，抗 原（10〜IOOjMg蛋 白 质 或 IO7个细胞)用弗氏完全佐剂乳化。等量的抗原和弗氏完全佐剂一起乳化成稠厚的乳剂，给小鼠、大鼠或仓鼠多点皮下注射（总 量 0 •5〜1.0 ml)。弗氏完全佐剂中经过热处理杀死的分枝杆菌可以引起炎症反应, 并募集淋巴细胞到抗原沉积的部位。 10〜14d 后 ，经过初次免疫应答产生弱抗体反应（以低亲和力的IgM 抗体为主）。典 型 的 免 疫 接 种 时 间 表
第一次加强免疫(第二次注射抗原)使用的是弗氏不完全佐剂（弗氏不完全佐剂不含热处理杀死的分枝杆菌，而弗氏完全佐剂中含有；弗氏完全佐剂的重复刺激可导致肉芽肿的形成，所以重复使用弗氏完全佐剂是不适当的）。抗原和弗氏不完全佐剂的乳化物也是多点皮下注射。对蛋白质抗原的再次应答，将产生增强的体液免疫，与初次免疫主要产生IgM 类抗体相比，加强免疫产生的抗体中Ig G 类抗体的数量明显增加。虽然第一次加强免疫后也可以检测到有意义的免疫应答，我们仍然建议进行第二次加强免疫，它能刺激免
疫应答的成熟，进一步扩增抗原反应性B 细胞的数量，增加血清抗体的效价。第二次加强免疫后的8〜10d，应该收集免疫后动物的血清，与免疫前血清一起比较对抗原的反应性 。类似的免疫接种时间表也可应用于用质粒D N A 进行的基因免疫接种。已经公开发表的免疫接种时间表有很多，它们在佐剂的选择、注射体积、抗原浓度、剂量及接种次数方面均有不同。前面给出的时间表是一个在多种动物模型中均取得了良好免疫效果的免疫接种时间表之一。
免疫后动物血清的反应性应该以多种稀释倍数，运用多种检测系统来确定体液免疫反应的强度和性质。由于血清组分的复杂性，检测时血清样品的稀释度通常应该大于1 : 50, 以减少非特异性结合。此 外 ，检测时应该包括大于1 : 1〇〇〇, 甚至超过1 : 1〇万的血清稀释度，以便更好地了解体内免疫应答的产生情况。血清效价的定义是: 在任何筛选试验中均能和抗原出现明显的、可检测到的反应的血清最大稀释度的倒数。
根据免疫原性质的不同，有多种筛选方法可以选择使用（在随后的部分详细讨论），包括酶联免疫吸附试验(ELISA )、流式细胞术、免疫沉淀或功能性中和试验。血清的抗体效价最好使用能够监测抗体预期功能的试验体系来评估。也就是说，如果制备的单克隆抗体是用来结合重组蛋白的，那 么 E L IS A 可能是最有效的筛选手段。然 而 ，如果制备的单克隆抗体是用来识别天然的细胞表面受体，那么筛选血清的方法就应该用流式细胞术或者用天然形式存在的抗原来筛选。重要的是要认识到，在一种试验体系中有功能的抗体可能会在另外一些实验体系失去结合活性。识别构象表位的抗体，在免疫印迹（Westernblot)中，由于蛋白质是变性的，可能不会出现结合反应；同样，识别隐藏在球形蛋白内部线性表位的抗体，可能不能抑制该蛋白质的功能活性。因此，在设计免疫程序和选择筛选手段时，对抗原的性质有清楚的认识及考虑制备抗体的用途是很重要的。通常, 如果免疫后血清效价> 1 : 1000, 建议继续进行随后的杂交瘤融合。如果血清效价< 1 : 1000, 应该继续加强免疫以增强机体对抗原的应答。
有时，即便经过多次加强免疫，也只能检测到很弱的免疫反应。虽然从那些低血清效价的动物也筛选到抗原特异性的杂交瘤细胞，但得到这种克隆的概率很低，并且通常是分泌 IgM 类抗体的杂交瘤细胞。在这些情况下，重新审查最初的免疫策略是明智的选择，可以改变抗原的形式，或者所用佐剂的种类。使 用 C F A /IF A 作为佐剂不能诱导产生有效免疫应答的抗原，在换用明矾作为佐剂后可能会大大提高免疫原性。
免疫后动物经过检测显示有意义的血清效价（> 1 : 1000) 后 ，动物应该「休息」3〜6周 。这段时间是让增强的二次应答衰减，以便在最后一次接触抗原后导致新的 B 细胞的活化和扩增。「休息」后的动物要接受最后一次融合前的冲击免疫，抗原用无热原的生理盐水或磷酸盐缓冲液稀释 (总量 200uL) ，不含佐剂。冲击免疫的最有效途径是静脉注射，可以将抗原直接输送到脾脏，脾脏中新活化的 B 母细胞收获后可用于做融合。如果抗原
不适合静脉注射 (如抗原是颗粒状的，或者含有的缓冲液成分可能有毒），可以采用不含佐剂的抗原腹腔内注射进行冲击免疫。不适合做静脉注射的成分包括弗氏佐剂、浓度大于0.1 % 的清洁剂/去垢剂，大 于 lmol/L 的尿素、内毒素、T ris 缓冲液、NaN3，或者超过生理浓度的缓冲液和盐水。经静脉注射冲击免疫后 3d(经腹腔内注射冲击免疫后 4d) ，收获免疫脾细胞或淋巴结细胞用于融合。
3 免疫程序
3.1 培 养 基 和 骨髓 瘤细 胞
制备分泌抗体的 B 细胞杂交瘤细胞依赖于抗原反应性B 细胞与永生化的B 细胞肿瘤细胞（骨髓瘤细胞）的高效率融合、随后的鉴定以及对能持续生长的能产生特异性抗体的细胞系的分离。对筛选了的杂交瘤细胞系的扩增培养需要很熟练的组织培养技术和对这些脆弱细胞的非常认真的照顾 [23]。虽然有多种不同的培养基和培养条件都可用于杂交瘤细胞的培养，但是在这里介绍一种可靠的方法，能够得到显著的结果（表 5. 3)。最好选择营养丰富的培养基培养细胞，因为细胞融合过程，以及随后的细胞扩增和低密度的亚
克 隆 ，对杂交瘤细胞都是很大的压力。符 合 这 些 条 件 的 一 种 培 养 基 是 高 糖（4. 5 g/L )DMEM(也 可 使 用 RPMI-1640 或 IMEM)。 D M E M 中 加 入 10% 〜 20% 的胎牛血清(FBS)、4 mmol/L 的 L-谷氨酰胺、l mm〇 l/L 的丙酮酸钠、50U/m l 的青霉素、50ug/m l 的链 霉 素 和 SOu mol/L 的 2-巯基乙醇 (2-ME) ，就成了 DM EM 完全培养基。制 备 和 培 养 杂 交 瘤 细 胞 所 需 的 试 剂
由于细胞培养时间长，所有的培养基组分都应该用 0. 22p m 的过滤器过滤除菌，而且在 4°C 储存的时间不能超过 2 周 。 F B S 优于其他来源的血清，因为它含牛的免疫球蛋白量 低 ，牛的免疫球蛋白可能会干扰后续抗体的筛选或纯化。在用于杂交瘤细胞培养前，也应该对不同批次的 FBS(或血清替代品）进行筛查，因为不同批次的 F B S 促进杂交瘤细胞的 生 长 能 力 不 同 。所 有 的 试 剂 都 必 须 是 无 支 原 体 污 染 的 ，而 且 内 毒 素 含 量 低（<0.25EU/ml)。在 DM EM 培养基中添加L-谷氨酰胺和丙酮酸钠，可以支持细胞的旺盛生长 。抗生素是可选的；然而，由于杂交瘤细胞的培养需要好几周时间的反复操作，因此，在培养基中添加对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌都起作用的抗生素是明智的。在支原体 染 的 情 况 下 ，用环丙沙星（ciprofloxation)(lO^g/ml)替代培养基中的青霉素和链霉素 ，至少培养5 代 。在培养基中加人2-M E 是有争议的，因为其作用机理不明。虽然在没有 2-M E 的情况下也能制备出杂交瘤，但是添加后对很多培养会有益处 。 一 旦在杂交瘤细胞的培养基中添加了 2-M E 后 ，就不能够再将其从培养液中去除了，因为这样做，可能会导致免疫球蛋白分泌或杂交瘤细胞生存能力的显著下降。
最近对杂交瘤细胞培养过程的改进包括研制出无血清或完全不含动物蛋白的培养基 。这对下游的杂交瘤细胞大规模扩增和单克隆抗体的生产提供了很好的选择。很多这样的新型培养基已被用于杂交瘤细胞的高密度培养和简化单抗的纯化程序。但这些新型培养基在杂交瘤细胞的起始培养中的效果还有待证明。在很多情况下，随着培养基中血清浓度的减少，抗体的产量会增加。
细胞融合后，培养的细胞要用药物进行选择，以清除那些未能融合形成杂交瘤细胞的骨髓瘤细胞。有很多筛选试剂可供选用，主要根据特定骨髓瘤细胞系特异的突变而定。HAT是最常用的筛选药物，表 5. 1 中 所 列 的 骨 髓 瘤 细 胞 系 都 可 用 此 药 物 进 行 筛 选 。HA T 可 通 过 多 种 商 业 途 径 买 到 ，由 次 黄 嘌 呤（hypoxanthine， 100pm〇l/L) 、 氨基蝶呤(aminopterin， 0. 4jumol/L)和胸腺啼陡（thymidine，16jamol/L )组成。氣基蝶呤可以阻断所有细胞内的嘌呤和嘧啶的从头合成途径。次黄嘌呤和胸苷可参与细胞内嘌呤和嘧啶的
补救合成途径（图 5.2 )。在杂交瘤细胞初始的生长及扩增过程中，可能需要添加一些额外的生长因子或补充物。虽然有些实验室会使用由滋养细胞层(脾细胞或腹腔巨噬细胞）产生的条件培养基「 conditioned media」, 但 是 也 可使用提供IL-6 来源的商品化的添加物(Origen HCF， IGENInc.， Gaithersburg， MD)。如果要使用滋养细胞层，应该在使用前1〜2d 将其接种在96孔细胞培养板中，每 孔 75/zl，含 4 X IO3 个腹腔灌洗细胞或IXl O4 个脾细胞 。这样确保滋养细胞产生了细胞因子，有利于杂交瘤细胞的生长，同时也能让研究者确认滋养细胞层是无污染的, 污染的滋养细胞会危及杂交瘤细胞的生长。另外，商品化的添加物应按商家推荐的浓度使用，一 般 是 1 % 〜5%(体积比），可以在使用时直接添加到培养基中。养细胞和商品化的添加物在促进新形成的杂交瘤细胞生长的效果方面基本相同。
前面提到的许多小鼠和大鼠的骨髓瘤细胞系都具有永生化生长的特性并能用药物进行筛选(表5. 1)。小鼠的骨髓瘤细胞系，最初都来源于由矿物油诱导Balb/c 小鼠产生的浆细胞瘤（MOPC21)，在体外经8-氮杂鸟嘌呤培养(P3K)和选择后，获得嘌呤核苷酸补救合成途径中酶缺陷的克隆（HGPRT- ) ，同时也不分泌免疫球蛋白的重链或轻链。这些骨髓瘤细胞在培养基中可以连续生长。然而，在有选择试剂（如氨基蝶呤、甲氨蝶呤或重氮丝氨酸)存在的情况下，核苷酸的从头合成途径被这些试剂阻断，这 些 缺 乏 HGPRT酶的杂交瘤细胞由于不能使用核酸合成补救合成途径而无法生存（图 5.2)。因此，这些骨髓瘤细胞就成了能用选择培养剂筛选杂交瘤的非常好的模型。图 5. 2 HAT选择培养的机制
骨髓瘤细胞应该装入冻存管后储存在液氮中，每次细胞融合解冻复苏一管新细胞。确保冻存的骨髓瘤细胞没有受到支原体污染非常重要，并且应该检查不存在任何传染性微生物，检查方法和前面提到的筛选免疫原时用的方法一样（小鼠抗体生产筛选试验，MAPS)。骨髓瘤细胞在融合前的培养时间不应超过两周，要始终保持细胞处于对数生长期 ，密度不超过IO6 个细胞/ml。骨髓瘤细胞通常用含i 〇 %FBS的 DMEM完全培养基培养（如前所述），每周传代 3 次 ，密 度 为 2. 5 X IO4〜10. OXlO4 个细胞/ml , 取决于不同骨髓瘤细胞的生长速度。常规地，应该取一些骨髓瘤细胞培养在含H A T 的选择培养基中，以
确定是否所有的细胞都会死亡、是否这些骨髓瘤细胞被污染、选择试剂是否有效等。在与抗原反应性B 细胞融合前，骨髓瘤细胞要用无血清培养基在4°C 条 件 下 洗 3 次 ，因为血清中蛋白质会干扰膜融合。用无血清的DMEM重悬骨髓瘤细胞，对其进行计数，调整浓度为I XlO7个细胞/ml, 放 在 4°C 。骨髓瘤细胞的活细胞比例应大于9 5 % 。
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