单克隆抗体的制备（三）

3.2 免 疫 B 细胞的制备

血清效价有意义(>1 : 1000)的免疫后动物可以提供抗原反应性B 细胞用于融合。这些细胞可以从脾脏或淋巴结中获得。动物用吸人CO2 处死，在无菌操作下取组织，放 在 4°C无血清培养基中，最多可放lh 。用慑子或针头轻轻打开组织脾脏或淋巴结的外包膜获得单细胞悬液，不能用毛玻璃磨碎组织取细胞，因为那样可损害细胞膜的完整性。在准备骨髓瘤细胞的同时，脾细胞或淋巴结细胞用无血清培养基洗3 次（4°C ，1000r/m in离 心 lOmin) ，计数并用 20m l 无血清培养基重悬，放 入 50m l 聚丙烯离心管，置于冰上。通 常 ，1 只免疫后小鼠可收获得IXlO8 个脾细胞，免疫后亚美尼亚仓鼠可收获得0.6X 108 个脾细胞。

3.3 融合和铺板

细胞融合前, 所有材料和设备都应准备好，培养基组分要预热到合适的温度（图 5. 3)。

B 细胞的融合程序

生物安全柜要彻底清洁，并 用 7 0 % 乙醇擦拭。所有培养基组分要滤过除菌。电子移液器应该安装有新的滤膜，多道移液器应该擦拭以减少任何污染机会。如果使用滋养细胞，含滋养细胞层的细胞培养板应该放在显微镜下检查细胞有没有污染。其他需要用到的物品包括计时器和2m l 、10m l 和 25m l 的移液管。免疫反应性B 细胞和骨髓瘤细胞重悬于无血清培养基中，并保存在4°C 条件下。下列组分要预热至37°C : 隔热的烧杯（充当水浴），5 0 % 聚乙二醇溶液（每个脾用lm l) ,IOml含 1 0 % F B S 的 DM EM 完全培养基，最后铺板用 的 含 2 0 % F B S 的 DMEM完全培养基。细胞计数，并计算活细胞比例，做记录。根据计数结果确疋骨髓瘤细胞的用重（见下述）和最后铺板所需的培养基用量（I X IO5 个细胞/孔）。

在细胞融合前将免疫淋巴细胞与骨髓瘤细胞按一定的比例混合。两 者 的比例由于使用动物的不同、骨髓瘤细胞系的不同，以及不同的实验室之间都会有少许的差异。在我们实验室，小鼠或大鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞（P3X63Ag8. 653)混 合 的 比 例 是 5: 1。亚美尼亚仓鼠脾细胞与骨髓瘤细胞混合的比例是4 : 1。为了更好地产生B 细胞杂交瘤，骨髓瘤细胞是按照适当的比例加人到免疫脾细胞或淋巴结细胞中的。例 如 ，2 X 107 个骨髓瘤细胞应该和I X l O 8 个小鼠脾细胞混合。混合细胞在50m l尖底离心管中混合后，在 4°C ,1000 r/min，离 心 lOmin。离心后，将上清液完全倒干净，将管底的细胞沉淀震动打散，使细胞均匀地铺在管底。将含有骨髓瘤细胞和B 细胞混合物的试管放在含有37°C 热水的隔热烧杯中。

以下的操作都在37°C 进行。在 37°C 的时候，细胞膜的流动性更大，这 对 由 p e g 1500介导的细胞融合过程是有利的。保温的细胞混合物、37°C 预 热 的 5 0 % PEG 、预热的含1 0 % F B S 的 D M EM 都放在超净台中。为了使免疫反应性B 细胞与骨髓瘤细胞融合，在37°C 水浴中，一边旋转轻轻摇动细胞管 ，一 边将混合细胞中逐滴加人lm l的 50% 的 PEG

溶液（lm in 内加完）。盛有混合细胞的锥形离心管与水平面应成一个角度，以便使每一滴P E G 都能轻轻地沿着细胞悬液的上缘与铺在管底的单个细胞均勻地混合。将融合细胞在 37°C 再 轻 轻 旋 转 30s 。随后，P E G 下 面 在 一 系 列 定 时 加 人 的 预 热 的 含 i 〇 %F B S 的

D M EM 中慢慢稀释。首先, 在37°C 的水浴中于2m in内边旋转边加入2m l预热的含10%F B S 的 DMEM，然后，同样在2m in内边混合边加人8m l的上述培养基。这种稀释的包含脾细胞、骨髓瘤细胞及新形成的杂交瘤的混合物在4°C 1000r/min离 心 lOmin。然后弃上清，细胞沉淀用含2 0 % F B S 的 D M EM 完全培养基轻轻重悬，使用大口径的移液管(25 ml)重悬。新形成的杂交瘤细胞很脆弱，不要用力振荡或涡旋。

将新生成的杂交瘤细胞重悬在适当体积的培养基中，使每孔约含细胞I X l O 5 个 ，接种在带低蒸发盖的9 6 孔板中。如果杂交瘤细胞要接种在已含有滋养细胞层（每 孔 75ul的腹腔灌洗细胞或脾细胞）的板中，那么新的融合细胞重悬后的浓度应为L 3 X 106 个细胞/ml , 每 孔 加 75^1， 这样铺板后的融合细胞密度为I X l O 5 个细胞/孔 。每孔细胞总体积

为 150/^1。 如果不使用滋养细胞，那 么 要 在 含 2 0 % FBS的 DMEM完全培养基中添加生长因子，如 添 加 1 % 〜5 % 的杂交瘤细胞克隆因子（Origen HCF, IGEN Inc.)。在这种情况 下 ，新生成的杂交瘤细胞重悬后的浓度应为6. 7 X IO5 个细胞/ml, 以 便 使铺板后每孔150/^1中含有I X l O 5 个细胞，跟前面描述的一样。每 孔 15〇沁含 I X l O 5 个融合细胞的细胞培养板在 37°C ，5 % CO2 和 9 5 % 湿度的条件下培养过夜。融合后第一天，细胞要在含H A T 的培养基里选择培养（每 孔 加 50jul的 含 2 0 % F B S 的 D M EM 完全培养基十4 倍浓度 的 HAT)。此时，每个孔里都有很多活细胞，没有或很少有细胞碎片。在融 合 后 的 24 h而不是融合的同时加入11八丁(50； /1，4 \ ^ ：八丁浓缩液），目的是使细胞从融合过程的最初压力中恢复过来，从而提高阳性克隆的产量。

细胞在选择培养基中培养（嘌呤和嘧啶生物合成的主要途径被氨基蝶呤阻断），骨髓瘤细胞（缺 乏 HGPRT)如果没有或没有有效地与脾细胞融合，将由于缺乏核酸补救合成途径所需的酶而开始死亡。同样，没有与骨髓瘤细胞融合的脾细胞在培养基中也只能活几天。培 养 3〜5d 后 ，能明显地观察到活细胞数量的减少和细胞碎片的增强。融合后第5 天开始，细胞培养板一周要换液三次。用吸管或多道移液器吸去一半的细胞培养上清(约lOOul)。无菌的移液器吸头插人培养孔的一半，将上清轻轻吸出，不要搅动底部的细胞 。然后补人1〇〇 〜125JU 丨含I X H A T 的新鲜DM EM 完全培养液（含 2 0 % FBS) ，如果最初没有使用滋养细胞的话，培养基中还应添加生长因子。常规地换液是给生长中的杂交瘤细胞补充营养物质，维持细胞健康、旺盛生长，去除细胞代谢产生的废物和死亡细胞碎片 ，减少培养孔中由未融合的B 细胞或不能増殖的不稳定杂交瘤细胞分泌的免疫球蛋白。通过给细胞频繁更换培养液，可以去除暂时表达的抗体，以减少筛选过程中假阳性孔出现的可能性。这在免疫后动物血清效价高（> 1 : 50 000)的融合中是很明显的。融合细胞要在含H A T 的选择培养基中培养大约2 周 。以后的培养可由H T 替 代 H A T ，因为未融合的骨髓瘤细胞已不复存在了，不再需要氨基蝶呤的选择作用了。

融合 后 约 14d，大多数细胞培养孔都显示细胞生长旺盛。检查细胞培养孔，可见葡萄串样的杂交瘤细胞团变得更加明显，并不断增大。根据接种时描述的条件（I X l O 5 个细胞/孔），每个细胞培养孔中都有可能长出多集落的杂交瘤细胞。每孔不一定是单克隆。一般来说，按照上面建议的细胞接种密度，8 0 % 以上的细胞培养孔中都应有活性分裂细胞 。如果含有活性分裂细胞的孔比例低，原因可能是融合时骨髓瘤细胞健康状态不好（如

细胞不处于对数生长期）、经静脉冲击免疫后B 细胞没有被有效地激活、细胞没有被有效融合、细胞培养条件不适当或支原体污染等。在大多数有杂交瘤细胞生长的培养孔中，当细胞生长达到铺满5 0 % 孔底时，此时细胞培养上清中的抗体（可 达 到 l ^g/ml)足以用来鉴定抗原。取一半的细胞培养上清用于抗体筛选试验。用于筛选试验的细胞培养上清应该是培养了 2d 的细胞培养上清，以使培养液中的抗体达到最高水平。每个细胞培养孔都必须使用一个单独的移液器吸头，以防止交叉污染。当细胞培养上清被转移到复制板中后 ，要给杂交瘤细胞补充新鲜的培养液（如上所述）。由于这些杂交瘤细胞是处于对数生长期，所 以在48 h 内确定筛选结果是必要的，以便对阳性克隆进行扩增或其他处理。杂交瘤细胞仍然用含H T 和 2 0 % F B S 的 DM EM 完全培养基培养。

3.4 筛选

有很多筛选策略可用于杂交瘤细胞的筛选。常见的方法包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫沉淀、结合抑制试验、流式细胞术、免疫印迹分析、免疫组化和功能中和试验等。在选择筛选方法时的一个重要思考是「你的抗体用于什么就用什么去筛」。筛选策略必须能够反映所需抗体随后的用途。例如，ELISA作为筛选手段筛出的抗体可能不能结合表达在细胞表面上的天然分子，这些分子要用流式细胞术检测。同样, 用功能中和试验筛选出的杂交瘤细胞分泌的抗体可能不能用于免疫印迹分析或免疫组化。

在选择筛选策略时，必须要考虑下面的因素：能够处理多达1000个样品（约 12 0 ul/样品）的能力、48 h 内完成鉴定的能力、是否具备必要的试剂/设 备 、反应的特异性、实验体系的灵敏性，以及最重要的是否能得到结果。筛选时要用融合前的免疫血清作为阳性对照。这将确保所有的技术、试剂、设备是最合适的。同样，用培养杂交瘤细胞的培养基(作为阴性对照）评估筛选结果也是很重要的。这种 含20%FBS及生长因子的培养基可能会干扰一些实验检测。例如，HAT/HT选择培养基中含有高浓度的胸腺嘧啶，在增殖实验中可

以阻止3 H-胸腺嘧啶的有效结合。为了鉴定出分泌所需单抗的杂交瘤克隆，通常需要用多个、多层次的筛选手段。用培养了 48 h 的杂交瘤细胞培养上清可用于多个筛选实验，多种筛选实验数据的汇总用来确定产生抗体的杂交瘤细胞。

免疫原的性质对筛选方法的选择也是有帮助的。用肽抗原制备的抗体筛查可将肽抗原结合在酶标板上，很容易地用ELISA进行筛选，然后进一步用其他的筛选方法以鉴定抗体的其他功能。流式细胞术可用来检测和表面球蛋白反应的抗体，然后再进一步用功能中和实验或配体结合抑制实验来筛选。另一个要考虑的事项是抗体的同种型。能特异性识别免疫球蛋白同种型的二抗可用来检测抗原反应性抗体是IgG 重 链 而 不 是 Ig M 重链 。重要的是，确定阳性克隆（和丢弃阴性克隆)必须依据两个独立的筛选试验的结果，即

使是完全相同的实验操作重复一次也是需要的。因为在筛选融合细胞时，重复试验有助于评估实验体系的重复性，减少出现假阳性或假阴性的风险，有助于鉴定出反应最强的细胞 系 ，并为选择杂交瘤细胞系提供多种参数。阳性克隆扩增后供进一步分析，而阴性克隆就舍弃了。重要的是要记住，最初筛选得到的阳性孔细胞并不是单克隆，可能呈现出多种结合特性。

3.5 亚 克 隆 和 低温 冻存

平均来说，用典型的融合方法制备的杂交瘤，1 % 〜3 % 的孔会分泌能够与抗原反应的抗体。一旦使用两个独立的筛选试验确定了阳性克隆，这些细胞应该立即进行亚克隆, 分离出能够分泌抗体的单克隆杂交瘤细胞，同时扩增并冻存该原始阳性克隆。阳性克隆中通常含有不止一种稳定的杂交瘤细胞，因此，必须再进行克隆，以便得到只分泌一种抗体的单个克隆的杂交瘤细胞。在原始孔中可能存在着不分泌抗体的杂交瘤细胞和含不稳定染色体的杂交瘤细胞，这些细胞的生长能力可能比分泌抗体的杂交瘤细胞更强。单细胞克隆化是一个漫长(数星期到数月）而辛苦的过程，但是对分离能够产生高水平预期抗体的稳定杂交瘤细胞是必需的。有几种同等价值的亚克隆方法可供使用，包括有限稀释法和软琼脂克隆法。

在这里，我们介绍有限稀释法，是一种简单、易操作的技术。无论选择哪种方法，杂交瘤细胞都要经历至少两轮亚克隆，以减少两个细胞正好黏在一起形成克隆的可能性。这不仅为分离单克隆杂交瘤细胞提供了机会，也为选择具备最佳生长特性和分泌高水平抗体的杂交瘤细胞提供了机会。培养低密度的杂交瘤细胞需要滋养细胞或条件培养基以提供生长所需的生因子。如上所述，滋养细胞可用同系动物的脾细胞、胸腺细胞或巨噬细胞。原代培养的细胞是生长因子的极好来源，由于其在体外生存能力有限，不会污染长期培养的杂交瘤细胞。从未接触过目的抗原的动物组织中制备单细胞悬液。这些细胞的铺板密度为2 X 104 个细胞/孔（与 细 胞 融 合 时 铺 板 的 滋 养 层 细 胞 密 度 相 比 ，亚 克 隆 过 程 要 用 更 高 的 细 胞 密度），0. Iml/孔（9 6 孔细胞培养板）。同样，滋养细胞层至少应该在使用前1 天 铺 板 ，使产生的生长因子积累在培养上清中，同时也可用来验证原代培养的细胞没有污染。另外 ，许 多商品化的生长因子补充剂（很多都含IL-6)可以取代饲养细胞的使用。克 隆 时 ，按照制造商的产品说明书将这些产品简单地加到培养基中就行了。

按照下面的操作程序可以获得单个克隆的细胞。对杂交瘤细胞进行适当的稀释以使细胞能以三种浓度铺板：100个细胞/孔 、1 0 个细胞/孔 和 1 个细胞/孔 。初始克隆鉴定出的抗体分泌阳性孔，让细胞生长到近8 0 % 的汇合，然后轻轻地重悬，并进行活细胞计数(不能被台酚蓝染色的确定为活细胞）。取 5000个活细胞转入装有5m l含 H T 的 DMEM完全培养基(亚克隆过程中最好不要改变培养基成分）的聚丙烯锥形管中，这样形成的细胞悬液浓度为1000个细胞/ml。利用这种细胞悬液，依次进行1〇倍稀释，便可分别得到浓 度 为 100个细胞/ m l和 1 0 个细胞/m l的细胞悬液。在两块已添加滋养细胞或补充成分 （100^1/孔）的 9 6 孔细胞培养板的最上面一行（A 行 )加 入 100^1浓 度 为 1000个细胞/ml的细胞悬液，使每孔含有100个有活力的杂交瘤细胞。这种密度的细胞，大 约 在 1〇 d 内能

生长到汇合。在每块细胞培养板的B 行 ，加 入 100^1浓 度 为 100个细胞/ml 的细胞悬液，使每孔中含有1 0 个有活力的杂交瘤细胞。在细胞培养板的其他几行（C 〜 H 行）加入100ul 浓 度 为 1 0 个 细 胞 /m l的 细 胞 悬 液 ，使 每 孔 中 含 有 i 个 有 活 力 的 杂 交 瘤 细 胞

(图 5.4 )。杂交瘤细胞的扩增和有限稀释法亚克隆程序

克隆很少或生长很慢，只能从接种较高密度接种的细胞孔中分离阳性克隆，因此，在一些孔中每孔接种1 0 个细胞或100个细胞，当不能从接种单个细胞的孔中得到克隆时，可以从这些孔中得到。这种分离得到的不一定是单克隆，应该进行多轮亚克隆筛选。最好是从 接 种 1 个细胞的培养孔中选择克隆。应该从视觉上检查每个培养孔中单独克隆的形成 。此外统计分析表明，在接 种 1 个 细 胞 的 培 养 孔 中 ，得 到 的 阳 性 孔 里 6 3 % 是单克隆[24]。每个原始阳性克隆都应该用有限稀释法进行至少两轮亚克隆。对每个原始克隆进 行 的 3 次亚克隆都鉴定是审慎的，扩增并冻存这些克隆以进行进一步亚克隆或分析。如果很难获得单克隆的杂交瘤细胞，可以在亚克隆前用流式细胞术对杂交瘤细胞进行分选 。杂交瘤细胞由于表达膜表面免疫球蛋白可以被染色，分 离 1 % 的阳性细胞，然后用有限稀释法铺板。这种方法可能有助于更迅速地分离和鉴定产生最高水平抗体的杂交瘤克

隆 。不能鉴定出任何阳性克隆可能是由于技术上的困难、铺板密度计算错误或者可能反映最初鉴定培养条件的严重不稳定性。在亚克隆的整个过程中都应该进行原始阳性克隆的培养，并监测抗体产生的稳定性。如果这一段时间细胞培养抗体检测始终是阳性的，那么它们可作为再次用有限稀释法进行亚克隆的细胞来源。如果在持续培养的过程中抗体产生变为阴性的话，说明这些细胞系可能是不稳定的。这时需要解冻冻存的原始克隆, 在体外扩增2〜3d，然 后 在 6 块或更多的9 6 孔板中进行亚克隆（如上所述）。这将是重新获得分泌特异性抗体杂交瘤细胞的最好机会。在亚克隆的过程中，通 常 有 高 达 2 0 % 的初始鉴定为阳性的克隆变为阴性，不再分泌抗体；因此，如果可能的话，应该鉴定多个分泌抗体的细胞系并建库冻存。

一旦单克隆的杂交瘤细胞系已确立并建库冻存，就应该换成不含H T 的培养基培养细胞，并逐渐减少任何生长因子的添加。这可能需要多次传代的适应过程，每代减少一半的生长因子。这期间，细胞的增长率可能会降低；然 而 ，这往往伴随着抗体产生的增加。在所有的添加物都已去除后，FBS的使用浓度也可减少。通常情况下，培养杂交瘤细胞的 FBS浓 度 可 以 从 20%、1 5 % 、1 2 % ，并 最 终 过 渡 到 10%。一 些 细 胞 系 ，甚 至 可 用 5%FBS培养，并最终用无血清培养基培养。每一步都应该对杂交瘤细胞的生长特性和抗体产生能力进行监测。单克隆的杂交瘤细胞确立后，其分泌的免疫球蛋白的同种型也能够被确定。有多种商用的试剂盒及试剂可供使用。同种型的鉴定对于选择抗体的纯化方法是至关重要的，也会影响特定抗体的功能。

原始的阳性克隆及头三次亚克隆的细胞株扩增后都应该冻存。单个孔的细胞扩增

慢 ，细胞密度维持在I Xl O5〜I X l O 6 个细胞/ml。冻存前，细胞应处于对数生长期。 4℃离心收集细胞，用已滤过除菌并预冷到4°C 的 含 1 0 % DM SO的培养基重悬细胞沉淀，并调整浓度为5 X 106 个细胞/ml。多管 装 有 I m l细胞悬液（5 X 106 个细胞）的冻存管先在一70°C 冻存数天，然后转移到液氮中长期储存。细胞系在鉴定和分离的每一阶段都应冻

存••包括初始融合时鉴定的阳性克隆，第一轮和第二轮亚克隆的阳性克隆。此 外 ，每一步应该冻存多个克隆，在关键的细胞系丢失后能从前面的冻存克隆中找回 。 一 般来说，每次克 隆 冻 存 1 0 管是合适的。液氮中的细胞可保持数十年，虽然隔几年将这些细胞复苏并重新冻存是明智的。

3.6 杂 交瘤 细 胞 的 扩 增

在产生特异性抗体的杂交瘤细胞分离、克隆并冻存建库后，扩增杂交瘤细胞可生产抗体 。处于对数生长期的杂交瘤细胞培养上清可产生3〜20p g /m l的抗体。根据实际所需单克隆抗体量，可选用不同杂交瘤扩增方法(第6 章）。扩增前，杂交瘤细胞必须是单克隆的 ，以防止不分泌抗体的细胞过度生长，降低抗体的产生。在很多情况下，需要的抗体量不 足 20 mg，那么使用细颈瓶或滚瓶简单的扩增细胞就可产生足够数量的抗体供使用。如果需要生产20〜200m g的抗体，可以使用滚瓶培养，或者使用经专门设计的能供细胞局密度生长的细颈瓶培养（CeLLine flask, Integra), 或者小型生物反应器扩增细胞。大规模的抗体生产需要专门设备和专门技术，或者从多轮小规模的抗体生产中累积得到。

杂交瘤细胞可以在多种不同类型的培养基中培养以进行扩增和抗体生产。许多杂交瘤细胞可在低浓度的血清（2 % 〜5 % ) 或专门的无血清培养基中生长。应该尽量使用牛免疫球蛋白含量低的血清培养杂交瘤细胞，以免在最后抗体制备中有其他的污染抗体。有专为杂交瘤细胞准备的无血清或不含任何动物蛋白的培养基可供购买，以利于抗体的生产和纯化。不同的杂交瘤细胞对不同类型的培养基的反应可能不同，因此在进行大规模扩增前，应该对其在不同类型培养基中的生长情况和抗体产生水平进行评估。在大规模扩增时还要考虑的一个因素是所用培养基的质量。所有试剂都应检测内毒素的污染情况 ；最好使用内毒素含量低于0. 2 EU/m l的试剂。内毒素污染可以改变体外培养细胞的反应，也可导致供体内使用的抗体无用。有多种产品可用于去除抗体中的内毒素，然 而 ，它们也常常导致大量蛋白质的丢失。细胞培养上清中的抗体，可直接用于多种实验体系(免疫沉淀、免疫印迹分析），但在许多应用中需要使用纯化的单克隆抗体。抗体纯化的方法 在 第 7 章讲述。抗体的纯化程序依赖于特异性抗体的种属来源和同种型。单克隆抗体化后，最后应该对抗体的特异性和质量进行监测。有一些参数可用于对抗体的评估，包括无菌、浓度（> 0. lmg/ml)、纯度（ 用 SDS-PAGE 检测）、相互凝集的情况、内毒素污染(在体内使用时< 〇.2EU/mg)和蛋白质 A 的污染（< 5 0 ng/ml)

4 结论

单克隆抗体是重要的研究工具、诊断试剂和临床治疗手段。方法学在抗原制备、免疫策略、高通量筛选和抗体生产等方面的不断发展加速了新型抗体试剂的产生、鉴定和生产 。如今，单克隆抗体不仅被用于研究和实验室诊断，并且已经被作为治疗试剂在多个领域都有广泛的用途，如移植、肿瘤学、感染性疾病和很多其他学科领域。此 外 ，抗体的修饰 ，包括添加标签、嵌合抗体、人源化抗体和基因工程抗体，都在扩大其在很多领域的用途 。表 5. 4 提供了一个网站列表，提供了一些关于已制备出的抗体和杂交瘤细胞的来源、操作手册、问题的诊断和解决方法指南、供应商和各种抗体相关链接的信息。许多商业机构可以为客户提供杂交瘤制备技术; 然而，对那些基本的组织培养技能的研究者，这里描述的方法为自己成功制备杂交瘤打下了基础。精心设计的免疫方案和筛选策略将会使你分离和鉴定出能分泌所需特异性抗体的独特的杂交瘤细胞。因此，杂交瘤技术的发展和抗体生产将继续履行他们的承诺：单克隆抗体在医学领域及工业上都是有应用价值的工具 [1]。