1、高通量测序在微生物多样性研究中的应用介绍
微生物环境基因组学又叫宏基因组学，它是研究某一环境样品中所包含的全部微生物的遗传组成及其群落多样性的一门科学，它是一种研究微生物多样性、开发新的生理活性物质（或获得新基因）的新理念和新方法。
第二代高通量测序技术为研究微生物群落结构提供了新的技术平台，并得到越来越多的应用和认可。与传统的微生物平板纯培养方法、微平板分析方法、磷脂脂肪酸法以及DGGE/TGGE/TTGE、T-RFLP、SSCP、FISH、印记杂交、定量PCR、基因芯片等分子生物学方法相比，具有如下优势：（1）不需要对微生物进行分离培养和纯化，因此该方法不受微生物人工培养特性的限制，(2) 能同时对样品中的优势物种、稀有物种及一些未知的物种进行检测，获得样品中的微生物群落组成，（3）并且在文库制备过程中，可以通过严格的技术手段将文库制备过程所带来的偏向性降至最低，所以应用高通量测序技术能准确地反映不同微生物间的相对丰度，（4）灵敏地探测出环境微生物群落结构随外界环境的改变而发生的极其微弱的变化，（5）成本相对较低。
2、高通量测序服务的基本流程
送样->核酸提取->PCR扩增->回收纯化->文库构建->高通量测序->数据分析->报告
3、质量保障体系
（1）PCR过程采用高保真酶以保证扩增的高保真、高效性以及无偏向性。
（2）标准化的实验操作流程和严格的质量控制体系。
（3）Q30比例>80%。
（4）专业的生物信息学分析能力，深入发掘数据的生物学意义。
4、报告样例
（1）片段长度分布图
有效序列：根据样品barcode（标签序列）提取有效测序，序列中含有特异性扩增引物序列，长度大于可供分析标准的序列称为有效序列。样品的目标区域16S rRNA的V4区的平均期望长度为292bp。双端测序正反向读取的序列总长为600bp，扣除分子标记24bp，共有576bp。双端读序列正确拼接且长度在242bp至342bp之间的序列被确定为有效序列。
所有样本的有效序列长度分布图如下：
其中占比最多的五种长度及其百分比分别为：292(96.51%)，291(2.81%)，290(0.57%)，293(0.09%)，294(0.01%)，其余长度占比为0.01%。
（2）Alpha多样性曲线
根据OTU数据，可以做出每个样品的（OTU相似水平为97%的）稀释曲线。样品的稀释曲线如下图所示（详细信息见rarefaction_plots.html）：
（3）Beta多样性曲线
物种累积曲线（Species Accumulation Curve）分析
物种累积曲线（species accumulation curves）用于描述随着抽样量的加大物种增加的状况，是理解调查样品的物种组成和预测物种丰富度的有效工具，在生物多样性和群落调查中，被广泛用于抽样量充分性的判断以及物种丰富度（species richness）的估计。因此，通过物种累积曲线不仅可以判断抽样量是否充分，在抽样量充分的前提下，运用物种累积曲线还可以对物种丰富度进行预测。
（4）OTU比较venn图
选择不多于五个样品的一组，分析样品间OTU重合情况，将结果以VENN图形式展示如下：
（5） PCA分析
（6） 群落结构组分图（共1组分析）
选定一个或多个需要分析的样品，选定一个分类学水平，按照相应多样性信息作图，反映各样品的群落结构。可选分类学水平：门、纲、目、科、属；同一组样品选择多个分类学水平为多组分析。
（7） 常规Heatmap图
选择多个样品，作出其在选定的分类学水平上群落结构Heatmap图。可选分类学水平：门、纲、目、科、属、OTU（97%）。如分析单元数目较多，默认使用占比较超过1%的种属或OTU作图。
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