实验方法原理
实验材料 动物组织 ［如肝、肾和（或）脾］
试剂、试剂盒 核缓冲液 A、B、C 无 Ca 和 Mg 离子（CMF） 的 PBSNaOH 2×TNESK 溶液CaCl2微球菌核酸酶（MNase） 储液
仪器、耗材 剃刀刀片或解剖刀培养皿带有聚四氟乙烯包被的磨棒的组织匀浆器电动组织磨碎机 相差显微镜 轻薄棉布玻璃离心管（如 Corex）带有定角转子的冷冻高速离心机超速离心机和超净管紫外分光光度
实验步骤
1. 处死动物或获得活体解剖后，将分离的组织放在置于冰上的 100 ml 烧杯中，马上用 25 ml 核缓冲液 A 冲洗。
2. 将组织转移到 100 mm 塑料培养皿中，置冰上，按以下量加入核缓冲液 A： 肝，8 ml；肾，5 ml； 脾，4 ml。将组织用剃刀刀片或解剖刀切割成大小为几毫米的小块。
3. 将每个小块移入不同的匀浆器。对于上述大小的组织，如果是肝或肾组织，用 15 ml 的匀浆器；如果是脾组织，用 10 ml 匀浆器。处理脾组织时，在冰上放置 10 min 之后再转移，以使血红细胞留在上清中。处理肝或肾组织时，可以马上丢弃上清。
4. 在所有的样本中加入 5 ml 新鲜的核缓冲液 A。混合，再次移去上清，然后再加入 5 ml 新鲜的核缓冲液 A 重悬组织块。
重要提示：从这一步开始，在冷室中进行所有操作。
5. 使用电动组织磨碎机匀浆组织 5～10 次，再手动匀浆 5 次。取少量匀桨混合物加入到 CMF PBS 中，在相差显微镜下观察。观察到的核是灰色的、很圆的小泡。如果仍然有完整的组织或细胞，再进行大约 5 次匀浆，再次观察细胞破碎的量。
6. 将轻薄棉布折叠成 8 层，在核缓冲液 A 中事先浸湿，过滤匀浆混合液到置于冰上的 30 ml Corex 管中。戴好手套，拧绞棉布使液体流尽。
7. 在 15 ml Corex 管中加入 1：1 核缓冲液 A/核缓冲液 B 作为缓冲层。用以下量的缓冲液 A＋B 混合液：肝，1.4 ml；背，1ml；脾，0.6 ml。将勻浆混合液加在缓冲层上。
8. 使用定角转子，40℃， 12 000 g （如 55-34 号转子 10 000 r/min） 离心 15 min。
9. 去上清，沉淀使用如下体积的核缓冲液 B 重悬：肝和肾，11ml； 脾，3.6 ml。先加入 2 ml 核缓冲液 B 轻柔地重悬沉淀成为黏稠的液体，再加入剩余的核缓冲液 B。
10. 在 1/2 in× 2 in的超净 SW50.1 离心管中加入 1.2 ml 核缓冲液 B 作为缓冲层，将重悬液各取 3.6 ml 加在其上（肝和肾分为 3 管，脾为 1 管）。
11. 4℃， 120 000 g （如 SW50.1 转子 37 000 r/min） 离心 90 min。
12. 倒掉上清，将离心管倒置在吸水纸上以去净余液。轻柔地将沉淀重悬于如下体积的核缓冲液 C 中：肝和肾，0.2 ml； 脾：0.25 ml。将同一组织来源的重悬液合并到一个管中，置冰上。
13. 取 5 ul 每种核重悬液加入到 2 ml 的 1 mol/L NaOH 中，用分光光度计测定 OD260。 用核缓冲液 C 稀释核重悬液至测得的 OD260 值为：肝 0.25； 肾和脾 0.085。
14. 每种核重悬液各取 1/5 与等体积的 2×TNESK 溶液混合。充分混合后，37℃ 温育过夜。
15. 将剩余的液体在冰上分到以下数目的反应管中：肝和肾，大于 6 个；脾，大约 3个。要经常摇动样品以防止结块。
16. 在第一个管中加入 0.1 mol/L CaCl2 至终浓度为 3 mmol/L， 37℃ 温育 3 min， 然后加入等体积的 2×TNESK 溶液，37℃ 温育过夜。
17. 在第二个管中加入 0.1 mol/L CaCl2 至终浓度为 3 mmol/L， 37℃ 温育1.5 min 加热核。
18. 在各管中分别加入所需量的 MNase。MNase 的部分消化，可以按如下的量进行尝试：肝和肾，0.1 U MNase/ml 反应液，0.2 U/ml、0.5 U/ml、1 U/ml、2 U/ml； 脾，0.5 U/ml 和 1 U/ml。MNase 的完全消化，尝试 10～100 U/ml。混匀，37℃ 温育 1.5 min。
19. 加入等体积的 2×TNESK 溶液终止反应，剧烈摇动管子几次混匀，37℃ 温育过夜。
20. 对每一个所使用的 MNase 浓度，重复步骤 17～19。
21. 纯化和鉴定 DNA。
注意事项
所有溶液、反应管、吸量管、吸头都必须为冰冷的。
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