4. 粒子轰击幼胚
(1) 幼胚渗透处理
轰击前，取分离 1 天后的幼胚，放在高渗培养基中处理 4 h。每皿 20~30 枚幼胚，置于培养皿中心 1.6 cm2 范围内，盾片朝上。胚可以放得紧密一些，但相互之间不要碰到。轰击之后幼胚继续高渗处理 16 h。
(2) 基因枪准备
① 基因枪所有组件和内部的枪体都要用 100% 乙醇清洗消毒。终止屏和载体膜浸泡在乙醇中消毒，然后晾干。破裂盘在用之前浸泡在异丙醇中，无需再消毒。
② 载体膜晾干后，先放入载体膜支架，然后吸取 3.5 μl 包裹了 DNA 的金粉微粒点到每张载体膜中央。吸取金粉微粒时注意保持悬浮状态。
(3) 基因枪参数
基因枪的各个组件在轰击室的位置如下：
破裂盘和载体膜之间的距离：2.2 cm
载体膜和终止屏之间的距离：1.3 cm
终止屏和样品架之间的距离：5.8 cm (枪体基部往上第三挡）
真空度：28 in.Hg.
(4) 粒子轰击
① 在轰击幼胚之前，基因枪先空轰击两次（见注 6) 。
② 将 1100 psi 的破裂盘在异丙醇中浸泡后放置在破裂盘固定帽内，然后将固定帽连接到基因枪腔体内的氮气气体加速管，基部旋紧。
③ 将终止屏放入微载体发射组件中，然后把点有金粉微粒并已干燥的载体膜放入载体膜支架，安装在固定槽中（载体膜有金粉微粒的一面朝下），旋上盖子，将微载体发射组件放在破裂盘固定帽下面的位置上。
④ 把放有幼胚的培养皿放在样品架上，样品架置于从轰击室底往上数的第三挡上，拿走培养皿盖，关上轰击室门，抽真空使真空度达到 28 in.Hg 后保持，然后轰击。
⑤ 当真空释放后，打开轰击室门，放回培养皿盖，准备下一次轰击。
⑥ 轰击后的幼胚在 25°C 暗培养。
5. 转化子筛选
( 1 ) 轰击后 16 h，将幼胚从高渗培养基转移到含有 5 mg/L 双丙氨膦的愈伤组织诱导培养基中进行选择，25℃ 暗培养。
( 2 ) 每隔两周更换一次含有 5 mg/L 双丙氨膦的愈伤组织诱导培养基。
( 3 ) 选择培养 4 周后，即第二次更换培养基时，将来源于同一个幼胚的愈伤组织分成 3~6 个小块，并做好标记，保证来源于同一个幼胚的所有愈伤组织在一起。
( 4 ) 选择培养 6 周后，即第三次更换培养基时，将剩余健康的愈伤组织转移到含有 1 mg/L 双丙氨膦的过渡培养基中，在 25℃ 弱光下培养，即把培养皿放到有光照的组织培养室中，在每个培养皿上盖一张薄纸片。
6. 转基因植株再生
( 1 ) 在过渡培养基上培养两周后，将来源于同一个幼胚的组织转移到再生培养基上（图 8.2) 。用深度大的培养皿，培养基不加任何生长调节剂，只含有 1 mg/L 双丙氨膦。每 2 周用同样的培养基进行继代，直到不再有新的再生苗长出。
( 2 ) 当幼苗的芽长到 2~3 cm，也形成根时，从培养皿中移出转移到含有 12 ml 愈伤诱导培养基的玻璃试管（Sigma C-5916) 中。培养基不加任何生长调节剂，只含有 1 mg/L 的双丙氨膦。
( 3 ) 当长根的幼苗长到试管顶部，就可以转移到土壤中。用长镊子轻轻地将幼苗从试管中移出，根部的组织培养基用水冲洗干净。
( 4 ) 将幼苗用同样的大麦生长介质种在直径为 5 cm 的盆中，幼苗上面盖一个有孔的塑料杯以保持湿度，直到幼苗在土壤中定植良好。
( 5 ) 当幼苗在土壤中扎根后，就可以采集叶片分析目的基因是否存在。双丙氨膦选择不像潮霉素选择那样（详见第 9 章 「农杆菌介导的大麦转化方法」），一些非转化的植株也可能存活。
( 6 ) 快速简易的检测再生植株转化状态的方法是用叶片进行除草剂抗性测试 [8]。
7. 用基因枪进行瞬时检测
基因枪轰击的一个重要用途是进行瞬时分析，常用于稳定转化前对载体的检测。在瞬时分析时，装有幼胚的培养皿一般轰击两次以提高 DNA 的转化量，建议在两次轰击间以 90° 角转动培养皿（见注 7 ) 。图 8.3 ( a ) 和图 8.3 ( b ) 分别是用含有葡萄糖苷酸酶基因( gus ) 和绿色突光蛋白基因（gfp）的金粉微粒轰击幼胚后进行瞬时表达的两个示例。
首页
