单克隆抗体制备技术

　　单克隆抗体制备技术

　　单克隆抗体制备标准化操作方案(McAb-sop)

　　 第一章: 小鼠免疫

　　 第二章: 细胞融合

　　 第三章: 细胞建株

　　 第四章: 细胞株鉴定

　　 第五章: 腹水制备

　　 第六章: 抗体纯化和鉴定（略）

　　第一章. 小鼠免疫(BALB/c)

　　 小鼠免疫是单抗制备的关键一环,质控小鼠免疫是制备优质单抗的唯一保证。

　　一.小鼠免疫分两程方案:根据免疫学原理小鼠免疫方案设计如下:

　　1.短程免疫方案:

　　 第一次: 1d 100ug(可溶性Ag)+等体积完全佐剂. 腹腔注射. 0.4ml/只

　　 第二次: 7d 100ug+等体积不完全佐剂 腹腔注射. 0.4ml/只

　　 第三次: 12d 50ug IV 0.3ml/只

　　(强化)第四次: 15d 20ug IV 0.3ml/只

　　 第17 d~24d内融合

　　 2长程免疫方案:

　　 第一次: 1d 100ug+等体积完全佐剂 腹腔注射(IP)0.4ml/只

　　 第二次: 14d 100ug+等体积不完全佐剂 IP 0.4ml/只

　　 第三次: 21d 100ug IP或IV 0.4ml/只

　　 第四次: 25d 50ug IV 0.3ml/只

　　(强化)第五次: 28d 20ug IV 0.3ml/只

　　 第30d~37d内融合.

　　 注意:a.在融合前(即加强免疫前)必须测定免疫鼠血清滴度,短程免疫滴度必须≥1:8000,长程免疫≥1:32000,方可做融合.b.免疫周期完成后所有小鼠需在一周内做完融合. 否则不能保证融合质量。 二． 小鼠免疫质控标准

　　1．免疫鼠血清滴度 短程≥1：8000，长程≥1：32000；

　　2．小鼠免疫后需在一周内做完融合；

　　3．免疫鼠脾脏明显大于空白鼠脾脏并且较粘连。

　　免疫鼠选择：免疫种类为:baleb/c小鼠；性别.雌性佳：大小：6-7周龄：体重：20g；

　　健壮.活泼。

　　 第二章．细胞融合

　　一． 融合前准备

　　1． 脾细胞：取符合免疫质控标准的鼠在无菌条件下取出其脾脏，并制成单个脾细胞悬液，每只鼠的脾细胞约1～3亿。在制备过程中严格保证无菌。制备脾细胞可选择研磨器+筛网或用无菌注射器吹吸。

　　2． SP2/0细胞准备：SP2/0细胞在融合前4天腹苏.并用8 -Ag筛选两次，隔天换液，在融合前一天换成普通培养基1640,10%小牛血清，SP2/0细胞数量在2000万～3500万为宜，细胞处于分裂期较佳，衰老细胞不宜使用。

　　3． PEG1450准备：取PEG1450干粉高压后加入等体积 PBS在60℃溶解即可使用，一次融合取0.8ml 50% PEG1450.

　　4． HAT培养基准备：根据铺板数量准备，20%小牛血清的HAT1640培养基.20ml/块板。

　　5． 终止液15-20ml:不含 Hepes的1640培养基或PBS（PH7.4）

　　二. 融合:

　　制备脾细胞悬液并用PBS(PH9.4)洗涤干净后混入SP2/0细胞按脾细胞比SP2/0=10:1～5:2混合并离心,1200rpm×５min 离心后滴干混合细胞.轻敲弹松细胞团块。在37℃水浴中加入PEG1450 0.8ml在50秒内加完

　　不宜吹打，加完后在37℃水浴中反应2min后加入终止液在 5min内加完15～20ml,加终止液时应沿管壁缓慢加入.动作应轻柔.不宜吹打以免使刚融合的细胞分离。

　　三. 融合后加样:

　　融合细胞终止后于900rpm×8min离心，并吸干以防残留PEG。离心后把融合细胞转入HAT培养基，并滴板200ul/孔，全过程应防止吹散融合细胞。

　　四. 换液:

　　待融合细胞在HAT中培养7天左右后（即未融合的SP2/0和脾细胞死后）换成HT培养基。200ul/孔 第8～10天检测。

　　 第三章．细胞建株

　　 一.融合板检测：

　　 待融合板换液细胞长至中等大小约1万个细胞以上开始检测（检测方法参见附表ELISA方法）在ELISA质控合格（即阴性对照<1.0，阳性对照>1.0）后挑选阳性孔（一般OD450≥0.5）作亚克隆。

　　 二.亚克隆方法及检测:

　　 挑出融合板阳性孔全部细胞加入8-10ml HT培养基，混均铺板4-6纵行；待亚克隆生长5-7天，克隆长大（约1万个细胞以上/孔），即可检测（用 ELISA方法）。

　　三.单克隆铺板和检测:

　　 挑取亚克隆检测阳性值高的孔计数作有限稀释4:2:1:0.5个细胞四个梯度铺板1个阳性细胞株/块。待单克隆生长7-10天，单克隆细胞长至中等大小（1万/孔）时进行检测，其中单克隆细胞≥8个/株（一般检测12个孔），待检测单克隆全阳后再进行一次同样的单克隆。

　　四．细胞株确立：

　　 待两次单克隆检测全阳后挑出三孔/株，作扩大培养于24孔板；24孔板细胞长满后作交叉Ag鉴定和稳定性鉴定（即再次测其培养上清看是否还能分泌单抗）鉴定合格后选择其中一株长势好.OD450箱高的扩大培养于细胞瓶，并进行冻存，5支/株，≥200万/支细胞。

　　 第四章．细胞株鉴定

　　 在细胞株冻存完毕后必须复苏同一批次中的一支进行鉴定。

　　鉴定标准：1.复苏活细胞数≥100万个细胞/支；

　　 2.活细胞中有活力细胞≥50万/株；

　　 3.复苏细胞中不能有除细胞株细胞以外的其它微生物(如:细 菌.真菌.支原体等)出现.

　　 4.复苏细胞生长到一定数目后选出生长好的细胞作单克隆计 数铺板.并检测单克隆的分泌抗体能力是否是否全阳或有抗体分泌.

　　 5.细胞培养上清也需作ELISA确定是否分泌抗体同时作交叉抗原复查,及 western-boltting鉴定是否为单抗。

　　 第五章．腹水制备及细胞株扩增

　　腹水制备：在细胞株鉴定合格后收集培养瓶中细胞，打小鼠腹水方法如下：

　　1. 小鼠选择：10周龄 baleb/c雌性小鼠，小鼠毛发油光，活泼约30克体重。

　　2. 打腹水前小鼠准备：选优鼠在打腹水前，7—30天内致敏小鼠选石蜡油（或其它矿物油）0.5ml/只IP(腹腔)注射。

　　3. 打腹水：收集合格杂交瘤细胞加于PBS（PH值7.4）或生理盐水(无菌)中,200万-500万/只鼠。IP

　　4. 腹水收集：杂交瘤细胞注入小鼠腹腔后5-7天即可产生腹水。（小鼠状态：腹部篷隆，小鼠精神萎靡，不思饮）此时可用无菌注射器抽取约2-5ml/只。腹水特点：血性或乳白色或微黄、脂性、略浓。一般隔天抽取一次，每只小鼠抽取三次即可处死。）

　　腹水保存：抽取腹水后置4℃过夜。离心500rpm×10min.取上清短期存放于4℃(3-7天)，中期1-2月放于-20℃，长期6月者存放于-80℃。

　　来源：上海领潮生物科技有限公司

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