生物标志物（Biomarker）的筛选与验证方案

　　临床样本都是宝，别让它们睡到死！！！

　　在与很多医生和老师的交流过程中，经常会收到这样的反馈：手上收集了很多临床样本，但是没有具体方案，不知道怎么利用，样本越收越多，冰箱越装越满，但最终这些样本一直是在睡大觉，睡到死！针对于此，本期向大家推荐吉凯完整的Biomarker筛选方案。进一步可开发试剂盒，完成临床转化，造福于民；退一步可发表高分文章。

　　今年7月，国家科技部发布了《“精准医学研究”重点专项2017年度项目申报指南建议》，建议指出“……建立多层次精准医学知识库体系和生物医学大数据共享平台，突破新一代生命组学大数据分析和临床应用技术，建立大规模疾病预警、诊断、治疗与疗效评价的生物标志物、靶标、制剂的实验和分析技术体系，形成重大疾病的精准防诊治方案和临床决策系统，建设中国人群典型疾病精准医疗临床方案的示范、应用和推广体系……”。

　　精准医疗的本质是通过基因组、蛋白质组等组学技术和医学前沿技术，对于大样本人群与特定疾病类型进行生物标记物的分析与鉴定、验证与应用，从而精确寻找到疾病的原因和治疗的靶点，并对一种疾病不同状态和过程进行精确分类，最终实现对于疾病和特定患者进行个性化精准治疗的目的，提高疾病诊治与预防的效益。

　　生物标志物（Biomarker）是指可以标记系统、器官、组织、细胞及亚细胞结构或功能的改变或可能发生的改变的生化指标，具有非常广泛的用途。不仅可从分子水平探讨发病机制，而且在准确、敏感地评价早期、低水平的损害方面有着独特的优势，可提供早期预警、预后疗效分析、疾病精准的分期分型依据等，在很大程度上为临床医生提供了辅助诊断的依据。由此不难看出，Biomarker与精准医疗的理念不谋而合，在疾病的准确诊断上有着高度统一。

　　利用不同组学技术通过高通量筛选寻找不同疾病发生原因、早诊、预后、分型等不同层面的Biomarker，对同一种疾病的不同状态和过程进行精确分类，从而在此基础上对于疾病和特定患者设计个性化精准治疗方案。在这一层面看来，Biomarker是精准医疗的前提，精确的Biomarker对于后续针对不同疾病实施精准医疗有着非常重大的意义，因此，Biomarker早期筛选和后期Panel的建立与验证就显得尤为重要。

　　针对于Biomarker的筛选与验证，吉凯整合多个平台，开发了整体一站式服务，在提出临床问题的基础上，提供样本与临床资料，即可完成从筛选到验证到试剂盒开发的整套流程。

　　临床问题提出：临床问题是Biomarker筛选的核心创新点，它可以是疾病的早诊预判、药物用药后的疗效分析，也可以是疾病分级判断或是预后疗效分析等等。但凡是在临床上可以提出的问题，并且可以收取相应样本，都可以作为Biomarker筛选的立足点。

　　临床样本分组积累与临床数据积累：临床样本是Biomarker筛选的基础，因此在提出临床问题的同时，需要考虑可以收取的样本量，从前期的筛选到后期的验证都是需要足够的样本支持，一般来说年收样本量最好在百例以上，样本来源多种多样，基本原则是无创或是微创的样本优先考虑，全血、血清、血浆、尿液、唾液、组织、脑脊液甚至FFPE都作为筛选样本。对于分组来说，至少有对照组与实验组，比较严谨的方案往往还会将实验组进行细分以及加入辅助分组。此外临床信息也十分重要，患者的临床资料、病理诊断结果、随访记录……这些临床信息是后期建立诊断Panel的基础，可以大大提高Biomarker的可靠性。

　　高通量筛选和数据分析：依据样本条件及个人兴趣选取相应的高通量筛选方法，从组学层面考虑，可以是基因组、转录组或蛋白质组，从筛选方法考虑，可以是测序、芯片、质谱等等。通过高通量手段获得的数据是非常庞大的，这时就需要拥有强大的生物信息学团队对原始数据进行分析，从中挖掘出有价值的东西（候选Biomarker）。

　　中低通量技术扩大样本验证：经过高通量筛选与生信分析，将挖掘出来的候选Biomarker再回归临床进行中低通量的扩大样本验证。不同层面的Biomarker可选取不同的方法，SNP/SNV用Sequenom，表达量、表观marker、CNV用qPCR，蛋白类可以用ELISA、western及IHC等方法。理论上讲验证样本数量越多越好，一般至少在百例左右。

　　新检测试剂盒开发： 获得Biomarker之后结合生物信息学分析建立诊断Panel，开发临床检测试剂盒，并进行临床检测，验证Panel的有效性。

　　篇幅受限，下面列举一个Biomarker筛选的经典案例：Plasma microRNA panel to diagnose hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma。这篇文献是由复旦大学附属中山医院肝癌研究所樊嘉教授领衔课题组在2011年发表于Journal of Clinical Oncology。文中利用Agilent microRNA芯片筛选、RT-PCR验证等方法在HBV相关肝癌患者血浆中筛选到了由7个microRNA组成的早期肝癌诊断分子标记物，该检测方法对小于2cm的HBV相关肝癌诊断准确率接近90%，效果明显优于传统检测方法。

　　按照Biomarker筛选整体方案解析一下这篇文献。第一，提出的临床问题为HBV相关的肝癌早诊，目标明确；第二，临床样本为微创收集的血浆，良好的Biomarker来源，且有详细的临床信息，对于分组来说除了对照组（正常人）和实验组（HBV相关肝癌患者）之外，还加入了辅助分组慢性乙型肝炎和肝硬化，设计严谨，有效排除可能存在的干扰；第三，利用miRNA芯片筛选到15个差异miRNA；第四，利用qPCR在407例样本中进行中低通量验证15个差异miRNA，缩小靶标miRNA范围至7个；第五，结合临床数据，重新进行生物信息学分析，建立Panel，再于390例样本中验证Panel的有效性，发现使用该panel对HBV相关肝癌早诊有效率高达94.1%，此外，区分区分肝癌与慢性乙型肝炎的准确率达84.2%，区分肝癌与肝硬化的准确率达88.4%。

　　Biomarker作为最直接快速有效的诊断手段，其筛选与获得可在疾病诊断、发展、治疗、以及疗效监测等多个方面发挥重要的作用。近年来寻找和发现有价值的Biomarker已经成为目前研究的一个重要热点。精准医疗是医学的未来发展方向，包括精准预防，诊断，治疗和预后四个层面。精准医疗发展关键在于Biomarker的发现与临床实践。

　　各位手头有临床样本的老师，赶快行动起来，别再让您的样本睡大觉。