A 原代细胞分离技术
取人或动物体内(或胚胎)的组织,将其剪碎至1mm3的组织块,再采用的如下方法进行分离培养:
一、悬浮细胞的分离方法
1、将血液、羊水、胸水或腹水等悬液直接转至离心管中,1000rpm/分钟离心5分钟。
2、去掉上清,离心沉淀用无钙、镁的PBS清洗后1000rpm/分钟离心5分钟。此步重复两次。
3、用培养基重悬,调整适当细胞浓度后分瓶培养。
4、如选用悬液中某种细胞,可采用离心后的细胞分层液收获目的细胞。
二、实体组织材料的分离方法
(一)机械分散法
1、纤维成分很少的脑组织,部分胚胎组织,用剪刀剪碎至1mm3的组织块。
2、用PBS清洗两次后
①用吸管吹打,分散组织细胞。
②或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内(用九号针),使细胞通过针头压出。
③或在不锈钢纱网内用钝物(注射器钝端)压挤使细胞从网孔中压挤出。
3、收集细胞转入离心管中,1000rpm/分钟离心5分钟。
4、去上清,加入含血清的培养基,重悬后移至培养瓶中培养。
(二)消化分离法
1、酶消化分离法(过夜冷消化法)
①细胞间质较少的软组织,如肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等,用Hanks液清洗组织三次,剪成碎块大小为4毫米左右。
②再用Hanks液洗2-3次以除去血球和脂肪组织。
③加入0.25%的胰蛋白酶,摇匀后放4℃过夜。
④次日再用Hanks液洗涤,弃去上清,共洗2-3次。
⑤加入少量含血清的培养基吹打分散,细胞计数,按适当的浓度分瓶培养。
2、非酶消化法(EDTA消化法)
①把组织块剪碎,呈1mm3大小的组织块。
②将碎组织块在平皿中用无钙镁PBS洗2-3次。
③加入消化液(胰蛋白酶或胶原酶或EDTA)于37℃水浴中作用适当时间(中间可轻摇1~2次),若组织块膨松呈絮状可终止,若变化不大可更换一次消化液,继续消化直至膨松絮状为止。
④弃去上清,加入含有钙、镁离子的培养基中止消化反应,并洗涤2-3次后,加入完全培养基。
⑤用吸管吹打,使细胞充分散开后用纱网过滤后分瓶培养。
B 原代细胞无血清培养技术
1、弃去培养基废液。
2、消化:加入1ml 0.125%胰酶溶液,转动培养瓶使酶液浸没瓶底,温浴消化2-3分钟。
3、终止:用无血清培养基终止酶反应。
4、离心:收集中和了的培养液,于15ml 的离心管中 1000rmp 离心10分钟。
5、细胞重悬:弃去上清,加入1ml 无血清培养基用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液。
6、细胞计数:血球计数板计数细胞,并换算出细胞数量。
7、接种分瓶: 将细胞接种到含4ml无血清培养基的培养瓶中,37℃,5% CO2培养箱中培养。
8、镜检观察:次日观察贴壁率,细胞形态等。
C 原代细胞培养技术
一、组织块直接培养法
1、取材,用Hank’s液洗涤三次,并剔除脂肪,结缔组织,血液等杂物。
2、用手术剪将组织剪切成1mm3左右的小块,再用Hank’s液洗三次。
3、将组织块转移至培养瓶,并贴附于瓶底面。
4、轻轻将培养瓶翻转,瓶底朝上,向瓶内注入适量的培养液,将培养瓶放置在37℃恒温箱内培养。
5、放置待组织小块贴附后,将培养瓶慢慢翻转平放,使组织浸入培养液中(勿使组织漂起),37℃继续培养。
二、消化培养法
1、取材,用Hank’s液洗涤三次,并剔除脂肪,结缔组织,血液等杂物。
2、用手术剪将组织剪切成1mm3左右的小块,再用Hank’s液洗三次。
3、视组织块量加入酶液,37℃中消化20—40分钟,每隔5分钟振荡一次,或用吸管吹打一次,使细胞分离。
4、加入3—5ml培养液以终止酶消化作用(或加入相关酶抑制剂)。
5、静置5—10分钟,使未分散的组织块下沉,取悬液加入到离心管中。
6、1000rpm,离心10分钟,弃上清液。
7、加入Hank’s液5ml,冲散细胞,再离心一次,弃上清液。
8、加入培养液1—2ml(视细胞量),血球计数板计数。
9、将细胞转移到培养瓶中,37℃下培养。
三、 器官培养
1、将不锈网做成支架形状,调整其高度至培养皿的1/2深度平面,在其表面放置0.5μm孔径滤膜。
2、将培养液加入培养皿中,使液面刚刚接触到滤膜,但不要使其浮起。
3、将要培养器官组织放在滤膜上,一般厚度不要超过200μm,水平面积不超过10mm2。
4、将上述准备好的培养物放入CO2培养箱,并加注氧气调整氧分压,最好到90%。
5、培养过程中要注意观察培养液平面,尽可能保持在与滤膜一致的水平上。
6、上述可进行器官培养1-3周,每2-3天换液一次,并根据情况做进一步实验和检测。
D 原代细胞传代技术
一、贴壁细胞的消化法传代
1、吸除或倒掉瓶内旧培养液。
2、加入1ml左右消化液(胰蛋白酶或与EDTA混合液)轻轻摇动培养瓶,使瓶底细胞都浸入溶液中。
3、消化2-5分钟后把培养瓶放置在显微镜下进行观察,发现原贴壁的细胞逐渐趋于圆形,在还未漂起时,弃去消化液,加入培养液终止消化。
4、用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液,分别接种到另外两到三个培养瓶中,置37℃培养箱中继续培养。第二天观察贴壁生长情况。
二、悬浮细胞的传代
1、直接传代
① 让悬浮细胞慢慢沉淀在瓶底后,将上清吸掉1/2-2/3。
② 用吸管吹打形成细胞悬液后,分别接种到另外两到三个培养瓶中,置37℃培养箱中培养。
2、离心法传代
① 将细胞连同培养液一并转移到离心管内,离心800-1000rpm,5分钟。
② 去除上清,加新的培养液到离心管内,用吸管吹打使之形成细胞悬液。
③ 将细胞悬液分别接种到另外两到三个培养瓶中,置37℃培养箱中培养。
E 原代细胞染色技术
一.台盼蓝染色
(1)制备单个细胞悬液,并作适当稀释(106细胞/ml)。
(2)染色:取9滴细胞悬液移入小试管中,加一滴0.4%台盼蓝溶液,混匀。
(3)计数:在3分钟内,用血球计数板分别计数活细胞和死细胞。
(4)镜下观察,死细胞被染成蓝色,而活细胞拒染。
(5)根据下式求细胞活力:
二.伊红Y染色
(1)制备1×106-5×106细胞/ml的细胞悬液。
(2)取0.1ml细胞悬液加0.1ml伊红Y染液混合。
(3)用计数板镜下计数活、死细胞数。
(4)镜下观察,着红色的为死细胞。按公式计算细胞活力。
三.苯胺黑染色实验
(1)制备1×106-5×106细胞/ml的细胞悬液。
(2)将1份1%苯胺黑溶液与含血清生理盐水作1:9混合稀释,使其成0.1%苯胺黑染液。
(3)取0.1ml细胞悬液加0.1ml苯胺黑染液混合。室温放置10分钟。
(4)用计数板镜下计数 ,黑色细胞为死细胞,按公式计算活细胞率。
F 原代细胞计数技术
1、准备计数板:用酒精清洁计数板及专用盖玻片,然后轻轻拭干。
2、制备细胞悬液:用消化液分散单层培养细胞或直接收集悬浮培养细胞,制成单个细胞悬液。要求细胞密度不低于104/ml,若细胞数很少,应将悬液离心(1000rpm,2分钟),重悬浮于少量培养液中。
3、加样:用习惯轻吹打细胞悬液,取少许细胞悬液,在计数板上盖玻片的一侧加微量细胞悬液。
4、计数:计算计数板四大格细胞总数,压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算:
细胞数/ml=4大格细胞总数/ 4×10000。
G 原代细胞鉴定技术
一、形态学鉴定
1. 在倒置显微镜中直接观察活细胞的形态学特征
2. 细胞染色检查 :
a) 将无菌玻片置于细胞培养皿中,加细胞悬液后培养;
b) 待细胞长满玻片后取出,用PBS清洗,之后放于载玻片上,待其自然干燥;
c) 用PBS/甲醇(1:1)固定15分钟;
d) 弃固定液,加合适的染色液染色;
e) 染色完毕后用清水洗净,置于空气中干燥,
f) 干燥后,用二甲苯透明,光学树脂封片后观察。
二、免疫组织细胞化学鉴定
1. 将无菌的盖玻片置于细胞培养皿中,将细胞悬液接种于培养皿中进行细胞爬片;
2. PBS清洗标本3次,各1 分钟;
3. 4%多聚甲醛固定15分钟;
4. 置于空气中干燥;
5. PBS清洗标本3次,各2 分钟;
6. 0.5%Triton X-100孵育 1次20分钟;
7. PBS清洗标本 3次 各2分钟;
8. 3%H2O2孵育 15分钟;
9. DPBS清洗标本 3次 各2 分钟;
10. 封闭血清孵育(5%正常二抗血清DPBS液20分钟)
11. 一抗孵育,4℃ 过夜或37℃ 60 分钟;
12. PBS清洗标本3次 各5 分钟;
13. 二抗工作液孵育(湿盒)37℃ 30 分钟;
14. PBS清洗标本3次 各5 分钟;
15. C液(湿盒) 37℃ 30 分钟;
16. PBS清洗标本3次,各5 分钟;
17. 用显色液进行显色;
18. 蒸馏水洗涤2次1 分钟;
19. 苏木素复染1分钟;
20. 清水洗涤30分钟;
21. 光学树脂封片后观察。
H 原代细胞冻存技术
1、选用生长情况好,数量较多的原代细胞,冻存前一天换液一次。
2、贴壁细胞需用0.25%胰酶常规消化将细胞消化下来,将细胞悬液收集至离心管中。
3、1000rpm离心5分钟,弃上清液。
4、沉淀加含DMSO的培养液,计数,调整至(1-10)×106/ml。
5、将悬液分至冻存管中,每管1 ml。
6、密封冻存管,封口一定要严,否则复苏时易出现爆裂。
7、用记号笔标明细胞种类,冻存日期。
8、按下列顺序降温:室温→4℃(20分钟〕→冰箱冷冻室(30分钟)→超低温冰箱(-80℃过夜)→液氮。
I 原代细胞复苏技术
1、取出细胞,迅速放入37℃温水中快速解冻。
2、吸出细胞悬液,并加10倍以上培养液。
3、1000r/分钟离心5分钟,去除上清。
4、用培养液适当稀释后接种培养瓶,放入37℃ CO2培养箱静置培养。
镜检细胞贴壁能力。次日更换一次培养液,继续培养。