摘要:目的 研究中药药对虎杖-桂枝对急性痛风性关节炎的影响。方法 取雄性 SD 大鼠 48 只,随机分为 6组(每组 8 只),即正常对照组,模型组,秋水仙碱组(0.1 g·kg-)1,虎杖-桂枝低、中、高剂量组(3.5,7,14 g·kg-)1。正常对照组和模型组给予等量生理盐水,其他各组给予相应药物灌胃,每天 1 次,连续 7 d。于灌胃的第 4 天.模型组与各给药组大鼠右后踝关节注射 25 mg·mL-1 尿酸钠(MSU)0.2 mL 1 次,正常对照组给予同量的生理盐 水,观察各组大鼠不同时间点足趾容积的变化;第 7 天灌胃 1 h 后取血,ELISA 法测定血清白细胞介素 1β(IL-1β)、转化生长因子-β(TGF-β)含量,荧光定量 PCR 检测外周血单核细胞 Toll 受体 2(TLR2)、Toll 受体 4(TLR4)及髓样分化因子 88(MyD88)的表达。取血后处死动物,取右后踝关节进行病理学观察。结果 与模型 组比较,在造模后 2 h 和 6 h 虎杖-桂枝药低、中剂量组可显著减小大鼠足趾容积率,48 h 和 72 h 虎杖-桂枝 药对低、中、高剂量组大鼠足趾容积均显著减小,差异有统计学意义(P < 0.05)。虎杖-桂枝药对各剂量组可不 同程度的减少关节滑膜炎症细胞浸润反应和血管充血程度。与模型组比较,虎杖-桂枝药对各剂量组可显著减 少 IL-1β 的含量,抑制 TLR2、TLR4 及 MyD88 基因的表达(P < 0.01)。结论 虎杖-桂枝药对低、中、高剂量 组对急性痛风性关节炎大鼠具有显著的改善作用,其机制可能是通过影响血中 IL-1β 的水平,下调 TLR2、 TLR4、MyD88 基因的表达来发挥作用。
关键词:虎杖-桂枝药对;痛风性关节炎;TLRs/MyD88 通路;大鼠急性痛风性关节炎是由血液尿酸增高,尿酸钠(MSU)结晶沉积于关节滑膜及周围组织而引起的急性炎症反应 [1]。临床治疗痛风的药物主要为化学药,长期使用具有较大的副作用,中药长期使用毒副作用小,具有显著优势。既往研]表明,含有虎杖的复方对痛风具有明显疗效;桂枝及其提取物能拮抗多种急、慢性炎症反应,具有显著的抗炎作用。
本课题组 前期研究[3]发现,药对虎杖 - 桂枝对急性痛风性关节 炎具有显著的改善作用,但其作用机制仍未阐明。 MSU 晶体作为一种危险信号被细胞表面和胞质的模 式识别受体,如 Toll 受体 2 (TLR2)、Toll 受体 4 (TLR4)、CD14 等分子所识别,TLR2/TLR4 与病原 相关分子模型(PAMPs)结合后,其本身结构发生二 聚化,活化髓样分化因子 88 (MyD88), 活化后的 MyD88 经过一系列的作用最终激活核转录因子 kappa B(NF-κB)以及后续白细胞介素 1β(IL-1β)的释放。 国内外研究[表明, 痛风出现的炎症发病机制与 TLRS/MyD88 信号转导通路密切相关。本研究通过建 立急性痛风性关节炎大鼠模型,探讨药对虎杖 - 桂 枝对急性性痛风性关节炎及 TLRS/MyD88 信号的影 响。
1 材料与方法
1.1 动物 SD 大鼠,雄性,SPF 级,体质量(200±20)g,广东省动物中心提供,动物许可证号:SCXK (粤)2008-0002。
1.2 药品及试剂 秋水仙碱,西双版纳药业有限责任 公司,批号:130313;尿酸钠,Sigma 公司,批号: BCBH7155V;虎杖、桂枝均购自康美药业,经本院 中药鉴定教研室李忠教授鉴定为真品。取虎杖、桂枝, 分别加 10 倍水, 浸泡 30 min, 虎杖煎煮 25 min,桂枝后下煎煮 20 min,过滤;药渣加 5 倍水, 煎煮 40 min,合并滤液,离心,上清液浓缩,定容, 灭菌,冷藏备用。MSU 溶液参考文献[2]方法制备。大鼠外周血淋巴细胞分离液,天津市灏洋生物制品科技 有限责任公司, 批号: LTS1083; Trizolf, 美国 intrivogen 公司,批号:15596-026。RNA 逆转录试剂 盒,Premix TapTM,SYBR Premix Ex TapTM Ⅱ , 均为 宝生物工程(大连)有限(Takara)公司产品,批号分 别为:RR047A、RR901A、RR820A;白细胞介素 1β (IL-1β)和肿瘤坏死因子-β (TGF-β) Elisa 试剂盒, 均为美国昂飞公司(eBioscience)产品, 批号分别为 BMS630 和BMS623。
1.3 仪器 YLS-7C 足趾容积测量仪,北京众实迪创 科技发展有限责任公司;NanoDrop 2000c 型紫外分光 光度计、MuLTiskan Go 型酶标仪, 美国赛默飞 (Thermo)公司;Mastercycler 型 PCR 扩增仪,德国艾 本德(eppendorf)公司;DOLPHIN-1D 型凝胶成像分析 仪,美国威泰克(Wealtec)公司;VIIA7 型荧光定量 PCR 仪,美国应用生物系统(ABI)公司。
1.分组、模型复制及给药 取 SD 大鼠 48 只,随机 分为 6 组(每组 8 只),即正常对照组,模型组,阳性药秋水仙碱组(0.1 g·kg-1),虎杖 - 桂枝低、中、高 剂量组(3.5,7,14 g·kg-1,分别相当于成人临床剂量
1.1,2,4 倍)。正常对照组和模型组给予等量的生 理盐水,其他各组给予相应药物灌胃,每天 1 次,连 续 7 d。于灌胃的第 4 天给药之前先测量大鼠右后足 趾容积,灌胃 1 h 后除正常对照组外,其余各组大鼠 乙醚麻醉,6 号针头针口斜面朝前上方与胫骨呈 45°夹角刺入右踝关节腔, 一次性注入 25 mg·mL-1 的 MSU 溶液 0.2 mL, 复制大鼠急性痛风性关节炎模型,并于造模后 2,6,24,48,72 h 分别在受试大 鼠踝关节相同部位,用足趾容积测量仪测量其容积。
1.样本采集及指标的检测 第 7 天给药后 1 h,眼 眶取血置于 EP 管和 EDTA-2K 抗凝管中,Elisa 试剂 盒检测 IL-1β 和 TGF-β 含量;Ficoll 法分离外周血单核细胞[8],采用 Trizol 法提取单核细胞的总 RNA,测 定 OD260 nm/OD280 nm 为 1.8~2.0 者采用,进行逆转录操作,严格按照试剂盒说明书进行,荧光定量 PCR 检 测 TLR2、TLR4、MyD88 表达水平。引物由宝生物 工程(大连)有限公司设计及合成, 以 β-actin 基因 序列为内参照物,引物序列见表 1。反应采用 20 μL 反应体系,严格按照 SYBR Premix Ex TapTM Ⅱ试剂 盒说明书进行。设置空白对照组的基因表达水平为1。公式 2- Ct=2-{ [Ct( 给药组)- Ct( 对照组)]} 目的基因 - {[Ct( 给药组)- Ct( 对照组)]}β-actin。处死大鼠,取右后踝关节,多聚甲醛溶液固定 24 h,置于 150 g·L-1 乙二胺四乙 酸(EDTA)中脱钙 1 周,常规脱水,石蜡包埋,经髁 突矢状面低温连续切片,厚度为 5 μm,HE 染色, 于光镜下观察病理组织形态学变化。
1.6 统计学处理方法 数据采用 SPSS19.0 统计软件 进行分析,结果以“x ± s”表示,方差齐性使用 LSD法进行比较,分级组间多重比较采用非参数秩和检验。
2 结果
2.1 药对虎杖-桂枝对急性痛风性关节炎大鼠足趾容
表 1 引物序列
Table 1 Primer sequences for PCR
基因 引物序列
β-actin F:5’-TgAgACCTTCAACACCCC-3’
R:5’-gCCATCTCTTgCTCgAAgTC-3’
TLR2 F:5’-ggCCACAggACTCAAgAgCA-3’
R:5’-AgAggCCTATCACAgCCATCAAg-3’
MyD88 F:5’- TATACCAACCCTTGCACCAAGTC-3’
R:5’- TCAGGCTCCAAGTCAGCTCATC-3’
TLR4 F:5’- CTCACAACTTCAGTGGCTGGATTTA-3’
R:5’- GTCTCCACAGCCACCAGATTCTC-3’
积的影响 与正常对照组比较,模型组在造模后不同 时间点大鼠足趾容积显著增大,差异有统计学意义 (P<0.05);与模型组比较,在造模后 2 h 与 6 h,虎 杖 - 桂枝低、中剂量药对组大鼠足趾容积显著减小, 差异有统计学意义(P<0.05);造模后 48 h 与 72 h 虎杖 - 桂枝药对低、中、高剂量组大鼠足趾容积均 显著减小,差异有统计学意义(P<0.05)。见表 2。
表 2 各组对急性痛风性关节炎大鼠不同时间点足趾容积率的比较(x ± s,n=8)
Table 2 Effect of herb pair Huzhang- Guizhi on the digital volume of rats with acute gouty arthritis induced by sodium urate at different
times
组别
剂量 / g·kg-1
足趾容积率 /%
0 h
2 h
6 h
24 h
48 h
72 h
正常对照组
2.09±0.06
2.12±0.06
2.070±0.08
2.092±0.06
2.099±0.06
2.100±0.08
模型组
2.14±0.08
3.24±0.53*
3.361±0.66 *
3.692±0.65*
2.664±0.31*
2.470±0.24*
秋水仙碱组
0.1
2.05±0.14
2.65±0.47▲
2.779±0.64▲
3.130±0.53
2.348±0.28▲
2.282±0.15▲
虎杖 - 桂枝低剂量组
3.5
2.05±0.12
2.77±0.52▲
2.980±0.48▲
3.107±0.59
2.456±0.26▲
2.313±0.17▲
虎杖 - 桂枝中剂量组
7
2.10±0.13
2.75±0.39▲
2.890±0.59▲
3.086±0.47
2.404±0.35▲
2.275±0.24▲
虎杖 - 桂枝高剂量组
14
2.04±0.15
3.09±0.44
3.353±0.50
3.517±0.49
2.544±0.31▲
2.352±0.18▲
注:与正常对照组比较,*P<0.05;与模型组比较,▲P<0.05。
2.2 滑膜组织学变化
见图 1。正常对照组膝关节软
膜细胞呈灶性增生,炎细胞弥漫性浸润,浸润的细胞
组织未见异常,滑膜组织光滑完整,软组织内可见正 主要为中性粒细胞﹑淋巴细胞。各给药滑膜及周围软常血管,纤维结缔组织无炎细胞浸润。模型组滑膜及 组织内见少量 - 中等量炎细胞浸润,部分小血管扩周围软组织广泛充血﹑水肿,表面有纤维素粘附,滑 张充血,间质纤维组织增生。参考文献标准[9]对滑膜
A. 正常对照组 B. 模型组 C. 秋水仙碱组 D. 虎杖 - 桂枝低剂量组 E. 虎杖 - 桂枝中剂量组 F. 虎杖 - 桂枝高剂量组
图 1 大鼠关节滑膜组织病理图(200×)的病理染色结果进行判断,模型组滑膜衬里增生、血 (P<0.05,P<0.01);虎杖 - 桂枝高剂量组在改善滑管充血、纤维素沉积、滑膜组织内炎症细胞浸润情况 膜衬里增生方面效果明显,与模型组比较,差异有统和总积分值均明显增加,与正常对照组比较,差异有 计学意义(P<0.01);虎杖 - 桂枝低、中剂量组在改统计学意义(P<0.01);虎杖 - 桂枝低、中、高剂量 善纤维素沉积方面效果明显,与模型组比较,差异有组血管充血、滑膜组织内炎症细胞浸润和总积分值均 统计学意义(P<0.05)。见表 3。
有显著降低, 与模型组比较, 差异有统计学意义
表 3 各组对滑膜组织的影响(x ± s,n=8)
Table 3 The impact of herb pair Huzhang- Guizhi on synovium of rats in different groups
组别
剂量 /g·kg-1
滑膜衬里增生
血管充血
纤维素沉积
滑膜组织内炎症细胞浸润
总积分
正常对照组
0.00±0.00
0.33±0.52
0.00±0.00
0.33±0.52
0.67±1.03
模型组
1.67±0.52**
2.00±0.00**
1.33±0.52**
2.83±0.41**
7.83±1.33**
秋水仙碱组
0.1
0.33±0.52
0.83±0.41▲▲
0.50±0.84▲
1.33±1.03▲▲
3.00±2.00▲▲
虎杖 - 桂枝低剂量组
3.5
1.17±0.75
0.83±0.41▲▲
0.50±0.84▲
1.83±0.98▲
4.33±2.16▲▲
虎杖 - 桂枝中剂量组
7
0.43±0.53
0.86±0.69▲▲
0.43±0.53▲
1.29±0.49▲▲
3.00±1.00▲▲
虎杖 - 桂枝高剂量组
14
0.14±0.38▲▲
0.86±0.38▲▲
0.57±0.53
1.43±0.53▲▲
3.00±1.41▲▲
注:与正常对照组比较,**P<0.01;与模型组比较,▲P<0.05 ,▲▲P<0.01。
2.3 药对虎杖-桂枝对急性痛风性关节炎大鼠血清IL-1β、TGF-β 含量的影响 与模型组比较,虎杖 - 桂枝低、中、高剂量组大鼠血清 IL-1β 表达量显著降 低,差异有统计学意义(P<0.01);虎杖 - 桂枝药对各剂量组 TGF-β 含量有所升高,但差异无统计学意义(P>0.05)
见表 4。
表 4 各组对大鼠急性痛风性关节炎血清 IL-1β、TGF-β 含量 的影响(x ± s,n=8)
Table 4 The impact of herb pair Huzhang- Guizhi on IL-1β and TGF-β in the serum of acute gouty arthritis rats
组别
剂量 /g·kg-1
IL-1β/pg·mL-1
TGF-β/pg·mL-1
正常对照组
17.11±3.86
71265.36±8516.58
模型组
142.74±15.44**
71118.25±9865.50
秋水仙碱组
0.1
23.55±8.99▲▲
103463.84±23942.53▲
虎杖 - 桂枝低剂量组
3.5
104.12±17.08▲▲
77454.98±7473.41
虎杖 - 桂枝中剂量组
7
49.86±12.55▲▲
78533.15±8279.73
虎杖 - 桂枝高剂量组
14
88.22±14.24▲▲
77035.92±6598.75
注:与正常对照组比较,**P<0.01;与模型组比较,▲P < 0.05,▲▲P < 0.01。
2.4 虎杖-桂枝药对对痛风性关节炎外周血 TLR2、 TLR4 及 MyD88 基因表达量的影响 模型组大鼠外 周血 TLR2、TLR4 及 MyD88 基因的表达水平显著升 高,与正常对照组比较, 差异有统计学意义(P<0.01)。虎杖 - 桂枝药对各剂量组大鼠外周血 TLR2、 TLR4 及 MyD88 的表达水平显著降低, 与模型组比 较,差异有统计学意义(P<0.01)。虎杖 - 桂枝中 剂量组对 MyD88、TLR4 表达的抑制作用与秋水仙碱组作用相近,差异无统计学意义(P>0.05),
3.5
3
**
**
**
正常对照组
2.5
模型组
2
▲▲#
▲▲#
▲▲#
秋水仙碱组
▲▲#
▲▲#
1.5
▲▲#
▲▲#
虎杖 - 桂枝低剂量组
▲▲
▲▲ ▲▲
▲▲ ▲▲
1
虎杖 - 桂枝中剂量组
0.5
虎杖 - 桂枝高剂量组
0
TLR2
MyD88
TLR4
注:与正常对照组比较,**P<0.01;与模型组比较,▲▲P<0.01;与秋
水仙碱组比较,#P < 0.05,##P < 0.01。
图 2 各组对大鼠急性痛风性关节炎 TLR2、MyD88、TLR4 表达的影响(x ± s,n=8)
Figure 2 The impact of herb pair Huzhang - Guizhi on the expression of TLR2、MyD88、TLR4 of acute gouty arthritis rats
3 讨论
中药药对是根据药性配对,药物间相互作用以达 到更好疗效的配伍形式,是方剂的重要组成部分。研究中药药对的作用,有利于掌握用药规律,阐明中药 复方的作用机制。虎杖微寒,可清热利湿﹑解毒,散 瘀止痛;桂枝辛温通络,且反佐制约苦寒伤阳凝瘀之 弊。因此,我们复制大鼠急性痛风性关节炎模型,研 究药对虎杖 - 桂枝对大鼠踝关节肿胀度以及对细胞 因子IL-1β、TGF-β 及 TLR2、TLR4/MyD88 信号的影 响,结果发现,虎杖 - 桂枝药对可抑制痛风性关节炎大鼠关节肿胀度,降低 IL-1β 含量、下调 TLR2 TLR4、MyD88 的基因表达,减轻炎症反应。 本实验研究采用经典的 MSU 注射大鼠踝关节造模方法,该方法会出现大鼠关节红肿、发热疼痛,行 走不便,具有急性痛风的特征。给予不同剂量的虎杖 - 桂枝药对后,大鼠关节的肿胀度明显缓解。病理学 研究也发现,不同剂量的中药药对虎杖 - 桂枝可减 少关节滑膜炎症、细胞浸润和血管充血。痛风是 MSU 结晶引起的炎症反应,细胞的炎症级联反应通 常是与单核巨噬细胞的刺激和活化而产生的炎症介质 有关,其中,包括 IL-1β,肿瘤坏死因子(TNF-α), IL-6 等,研究已经证实 IL-1β 是单核细胞的细胞系 产生的最重要的促炎细胞因子,并且 IL-1β 的产生 是急性痛风性炎症发病的必要物质[10-11]。转换生长因 子 β 受体(TGF-β)对细胞的生长、分化和免疫功能 都有重要的调节作用, 其中, TGF-β1 又可抑制 IL-1、IL-6 的合成与致炎活性。急性痛风炎症发病 期间,IL-1β 的含量显著性增加,后期 TGF-β1 的含 量上调诱导痛风的自发缓解,通过多个方面抑制炎症反应也得到了验证。本实验结果表明,不同剂量的 虎杖 - 桂枝药对均可不同程度的降低 IL-1β 的含量, 减轻机体炎症反应的作用。
Toll 受体(TLRs)是先天免疫的识别受体,能够识 别 PAMPs 和损伤相关分子模型(DAMPs),主要表达 于免疫细胞, 包括单核细胞、巨噬细胞和粒细胞 等[13-14]。TLRs 属于Ⅰ型跨膜蛋白受体,多数 TLRs 有 细胞质 Toll/IL-1 受体(IL-1R)域,它是激活下游信号 途径所需的部位,从而导致 NF-κB 的活化[6],并诱导 炎症因子如 IL-1 和粘附分子等基因的表达,国外研 究[14-15]表明,IL-1β 的产生确实与 TLR4 的激活有关。 髓样分化因子 88(MyD88)是一种转接蛋白,TLRs 通 过 MyD88 依赖性途径或 MyD88 非依赖性途径进行信 号传递,识别入侵病原体,激活天然免疫,其中, TLR2 是由 MyD88 依赖性途径介导的;TLR4 可同时 经过 MyD88 和 TRIF 两条途径进行信号传导,MyD88 在 MSU 产生免疫反应中是必不可少的转接蛋白[11-15],
此通路在炎症发病中具有重要作用。本实验结果显 示:模型组 TLR2、TLR4、MyD88、IL-1β 表达量均 显著性增高,可激活 TLRS/MyD88 信号通路,促使 IL-1β 的合成释放,增强机体的炎症反应。各给药组 均能不同程度下调 TLR2、TLR4、MyD88 的表达量而 减少 IL-1β 的表达量,抑制机体的炎症反应。
药对虎杖 - 桂枝对痛风性关节炎大鼠模型急性炎症有明显的抑制作用,可缓解关节肿胀,减少关 节滑膜炎症细胞浸润反应和血管充血。其作用可能 是通过抑制 IL-1β 的分泌, 抑制炎症过程中的 TLR2、TLR4/MyD88 信号通路,减少炎症因子的生 成。TLRs/MyD88 信号通路是治疗痛风一个非常有前 景的靶点,为后续探讨中药治疗痛风作用奠定了基 础。
来源:北京众实迪创科技发展有限责任公司
联系电话:400-016-4066(免费电话);010-85376599
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