EEE. 电泳用的是恒流，一块胶，20mA，100分钟左右。转膜也是恒流，38mA，100分钟。而且我用别人的细胞和一抗在我的整个反应体系下做出来了，当然彼此的目的蛋白不同。所以，我想问题应该出在抗原和一抗上，不知对不对。
解答：电泳的条件：样品的分子量决定了胶的浓度，一般使样品跑至胶的中部即可。正常条件下，电泳时溴酚蓝和10kd左右蛋白跑在一起。由此可以决定电泳的电压和时间。建议你用恒压80－100伏。
FFF. BIO-RAD的半干转运系统有一个很致命的弱点就是无法控温（我用的就是这种），当电流过高，而系统的散热又比较差，滤纸的吸水性比较差的情况下，就很容易烧胶。
就转膜时，是采取恒压还是恒流的问题，我想和大家探讨一下，我感觉我这个系统用恒流很容易烧胶，我的胶有68cm2，用50mA恒流来转膜，刚开始电压就很高，有20
v左右，而用恒压，开始电流有110mA，但15min后，电流就降到8OmA，30min后就稳定在40mA，不就相当于恒流吗？
解答：恒流时电压逐渐升高的原因是湿滤纸逐渐变干因而电阻逐渐增大的缘故，如果电压升得太快，可以使滤纸更湿一些以克服。就我的感觉，20V的电流30min以后20Kd以下的分子丢失很多，不过我用的是小胶40cm2，不知有无不同。
GGG. 我想尽量提高转膜的效率（我的实验要求转到膜上的蛋白越多越好，不管是什么大小蛋白）不知道有那些办法？
解答：不管怎么转都会存在蛋白转移不完全（电压过小时间过短）或过度转移（电压过大时间过长）的问题，鱼（小分子量蛋白）和熊掌（大分子量蛋白）不可得兼呵呵。建议把胶切成两半，比如以35KD为界，分别进行转膜，下半时间短，上半时间长一点，应该会好一些。
HHH. 请问一下PVDF膜和硝酸膜结合蛋白的原理是什么？
解答：一般而言，硝酸纤维素膜是通过疏水作用来和蛋白质相联，这样的话，反复洗几次后，蛋白容易掉下来，结果较差。尼龙膜主要通过它膜上的正电荷和蛋白接合（注：常用的PVDF即带正电荷的尼龙膜），同时也有疏水作用，但相对较弱。这样的话，PVDF膜和蛋白接合较牢，不易脱落，结果较好。
III.
1、煮好后的样品，若没有及时上样分离，应如何保存，可以保存多久？2、有没有人在用bio-rad的小型垂直电泳槽，有没有操作手册？3、湿式转移时是否必须要用bio-rad的专用滤纸？4、恒压转移的条件如何确定，因为我要分离小至21KD，中至66KD，大致170KD的蛋白质，转移条件能够相同吗？5、凝胶的浓度是不是可以用一个浓度？书上写不同的凝胶浓度分离的分子量范围不同，还给出了一个线形范围，是不是不在这个范围内也能分离，只是就不是线性范围了？
解答：1、煮好后的样品，放到-20，我们在一个月后此样品，效果一样。
2、bio-rad的小型垂直电泳槽的操作手册在他们的主页Bio-Rad USA上有。
3、转移时一般的WATERMEN滤纸就可以。
4、转移条件是和蛋白质大小有关的：以次确定电压和时间。具体可让ptglab帮你定夺。
5、凝胶的浓度也是和分离蛋白质大小有关。不是随心所欲选的，否则分离效果可能不是你所期望的。
JJJ. 怎样设计实验来确定最佳的条件？
解答：随便说一点， 具体的还是需要自己想：
1、在每个上样孔里上同样的蛋白样品，量也一样，最好是组织样，（也可以跑1 个大 well， 不插梳子，多上样，）SDS-page；
2、转移， 设定电流或电压；
3、每隔 1（or n） 小时，取一点膜染色，看转移效果。
KKK. 我要测两种抗体，一种为磷酸化的目的蛋白，一种为总的目的蛋白，不知道用什么方法strip最好，我用甘氨酸（PH2.9）漂洗15分钟，似乎没什么效果？
解答：你可以加巯基乙醇（loading buffer 一样的浓度），56度， 30mins，看看。
LLL.
1、在用PBS洗涤抗原-抗体-ProteinA-Agarose复合物时，每次要重悬多长时间合适？2、最后用2xSDS重悬抗原-抗体复合物离心后，由于2XSDS中已经加入了溴芬兰，因此下面的Agarose珠子几乎看不到，所以吸取上清加样时也不知道里面是否吸进了Agarose。不知有什么方法可以解决这个问题，或者即使吸进了一些Agarose也不要紧呢？
解答：1、不用重悬多久，重悬起来了就可以离心了。
2、加2X
BUFFER前大体上已经知道有多少胶粒了，吸到那个位置时小心点就是了。我也试过一些次，首先离心稍微长一点，长20秒吧，希望胶粒能沉得结实点（我想象的），再吸取。如果感觉枪头不是很顺畅的时候可能就是碰到胶粒了。很难一点胶粒也吸取不上来的，尽力做好就是了。
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