间接放射免疫法检测待测样品mTNF基本原理和操作方法

肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）是一类能直接导致某些肿瘤细胞坏死的细胞因子，有TNF-α与TNF-β两种类型。

TNF-α主要来源于活化的单核/巨噬细胞，TNF-β主要来源于活化的T淋巴细胞。虽然两型TNF的细胞来源不同，结构也不同，但均能与不同的受体结合，故具有极其相似的生物学活性。TNF可进入体液成为分泌型（或可溶性）TNF（sTNF），也可与细胞膜结合成为跨膜型（或膜结合型）TNF（mTNF）。应用标记的抗TNF特异性抗体，利用抗原抗体反应检测TNF即为TNF的免疫学检测法。可检测待测样品中sTNF的精确定量，也可检测mTNF，还可区分TNF-α与TNF-β两种类型。主要方法有ELISA法、RIA法、FIA、FCM或FACS法等。

一、基本原理
选用两种抗体，一抗为抗 TNF抗体，可与细胞膜表面的mTNF特异性结合；二抗为抗一抗抗体，且标记放射性同位数125I，可与一抗特异性结合，通过测定其放射活性，并与标准品对照，即可间接测定细胞膜表面的TNF。

二、材料和试剂

（1）1%多聚甲醛

（2）含3%牛血清白蛋白的PBS（3%BSA-PBS）及PBS

（3）一抗：兔抗TNF的抗血清

（4）二抗：125I标记的驴抗兔IgG

（5）未免疫兔血清

（6）制备好的巨噬细胞悬液（细胞浓度为1×106ml）

（7）96孔PVC板（聚本乙稀板）

（8）γ-计数仪，温浴箱，刻度吸管，毛细吸管，加样器（头）

三、操作步骤

（1）将准备好的巨噬细胞悬液加入PVC板各孔中，0.1ml/孔，再用1%多聚甲醛固定于PVC板中，然后用PBS洗去多余的多聚甲醛；

（2）设立不同倍比稀释度的TNF标准品；（3）加入3%BSA-PBS，每孔0.1ml， 37℃孵育1h，以封闭抗体非特异性结合位点；

（3）加入3%BSA-PBS，每孔0.1ml， 37℃孵育1h，以封闭抗体非特异性结合位点；

（4）弃上清，每孔加入1：50稀释度的兔抗TNF血清（一抗）。以未免疫兔血清作为阴性对照，37℃孵育45min；（5）用PBS洗3次，以去除未结合的一抗；

（6）加入125I标记的驴抗兔IgG（二抗，2000cpm/孔），37℃孵育45min；

（7）用PBS充分洗板后，用γ-计数仪测量放射活性；

（8）从标准曲线中即可求得待测细胞mTNF含量