(1)样品洗毕后(见前)，悬于含1％正常羊IgG的中。在1．5ml锥形管中胚胎或其他样品所占体积应少于50txl，或在5mlap-top管中应少于200／A。摇动孵育1h。
(2)用洗2次。
(3)加一抗：用含蛋白质的溶液，如含羊IgG的制备不同稀释度的抗体。单克隆抗体最好来自杂交瘤细胞培养上清(特异性抗体浓度为20—50ug／m1；以1：10稀释度作起点为佳)。小鼠腹水或纯化的单克隆抗体和多克隆抗体以及粗制的多克隆抗血清应测试一定范围内的稀释度，从而使特异性抗体浓度达到0．01—1Pg／ml。如果特异性抗体浓度是未知的，应制备并测试原始制品的不同稀释度(1：10，1：100，1：1000和1：10000)。
(4)在4℃孵育24h。
(5)用洗3次，每次5min以上。缓冲液中可以含1％TritonX-100或-40，以降低背景。
在此方法中，以未免疫的羊IgG作为封闭剂，即从正常羊血清中通过蛋白G纯化制备。因本文推荐的标记二抗是羊抗鼠(或兔)免疫球蛋白抗体，故选择羊IgG作为封闭试剂。如使用的是另一来源的标记二级试剂，则应改用其他封闭剂，如可选用3％牛血清白蛋白。
(6)加标记的二级试剂：用含蛋白质的溶液，如1％正常羊IgG／制备不同稀释度的二级试剂。常用的二抗试剂包括抗免疫球蛋白抗体、蛋白A或蛋白G。一般而言，建议使用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠(或兔)免疫球蛋白二抗。标记的二级试剂可以购自供应商，如使用商业来源的标记二级试剂，其稀释度可从1：50至1：1000。碱性磷酸酶标记的试剂应用Tris缓冲液稀释，而不用。
(7)加标记的二抗试剂，4℃孵育1h。
(8)用洗3次，每次5min以上。中可以含1％TritonX-100或-40，降低背景。
(9)将6mgDAB溶解在9m10．05mol／LTris缓冲液中(pH7．6)。
(10)加入lml 0．3％(W／V)氯化镍贮液，也可用等量的氯化钴替代。
(11)加0．1ml 3％过氧化氢溶液(用水配制)，通常供应的过氧化氢为30％，4℃下可保存1个月左右。
(12)如果有沉淀出现，可用Whatmanl号滤纸(或相应的)过滤。
(13)将底物溶液加至样本中，孵育1—20min，用水冲洗终止反应。在显微镜下观察颜色的变化以便判断终止反应的适当时间。
(14)优化选择：在高倍镜下观察胚胎时，胚胎的直观视觉模式和通过胚胎的光路长度常引起标本出现不透明的现象。为了克服这一特点，通常用不同的试剂处理胚胎，这样将能改变胚胎的折射指数。可将胚胎在甘油或甲基水杨酸盐溶液中孵育。对于大多数染色标本以甘油效果较好。
将胚胎重悬于500弘l的甘油／(50：50)混合液中，于室温下孵育1h。
离心胚胎，重悬于70：30的甘油／混合液中。
经过甲基水杨酸盐溶液处理的标本清晰度比甘油更好，但它易挥发，使一些工作者难于忍受这种气味。此外，它没有黏度，使得对胚胎的处理较容易。可先将胚胎通过一系列乙醇处理：50％l醇5min，70％乙醇5min，90％乙醇5min，100％乙醇5min，各2次。再加500~1甲基水杨酸盐溶液，作用10min，不应摇动试管。胚胎将沉到底部。去除上清并加新鲜的甲基水杨酸盐溶液。最后用甘油代替甲基水杨酸盐溶液。
(15)样品观察：将用甘油洗过的样品转到玻片上。在解剖显微镜下观察胚胎，并挑选一部分在高倍镜下检查。
在一洁净的载玻片上放2张盖玻片(井1)，中间间隔lcm，以准备一个观察小室。在这间隔区加上70：30的甘油／溶液。由于毛细作用就可以使该溶液进入盖玻片下。将所研究的胚胎转至该观察区，并盖上第3张盖玻片。应避免气泡的形成。来回推盖玻片，以便寻求到最佳方向进行观察。
(16)观察并照相。
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