(1)将盖玻片、载玻片或培养板置于水平面上；如为1h或1h以下的短程孵育，则勿需湿孵，可将盖玻片或载玻片直接放置在实验台上。多个盖玻片则需置于Parafilm膜上，因为Parafilm膜有弹性，能够防止抗体溢出盖玻片边缘，也便于镊子操作。但如果圆形盖玻片数量过多，最好将其置于细胞生长与固定的24孔培养板中。
如果孵育时间>1h，则需将其置于培养皿或湿盒中以利湿孵。有几种方法可供放置盖玻片或载玻片选用，以便于操作和湿孵，可依具体情况选用。例如，在培养皿上铺一层水饱和的滤纸，再将载玻片置于滤纸上。盖玻片亦可经类似处理。如用24孔培养板，则需在板盖上铺一层潮湿的滤纸来保持湿度。
如孵育时间超过1h，可将抗体溶液加在Parafilm膜上的玻片上，再将盖玻片或载玻片(样品面朝-F)盖在抗体溶液上。孵育完毕后用洗涤。

左为用盖玻片在石蜡膜上操作右为在24孔板中操作
(2)加入一抗：加入足够量的一抗使其覆盖细胞，但不要溢出盖玻片或载玻片边缘，通常加入iotA。所有稀释液必须用蛋白质溶液配置，如3％A／；
单克隆抗体通常为组织培养上清液(特异性抗体浓度为20～50ug／m1，未稀释)。腹水、纯化的单克隆和多克隆抗体以及粗制的多克隆血清应该进行稀释度测定。如果特异性抗体的浓度是未知的，应测试初始样品的不同稀释度(1：10，1：100，1：1 000，1：10 000)。
(3)盖玻片、载玻片或平皿的孵育，在室温下至少30 min。超过30 min则需湿孵或采用步骤(1)所述的方法。对于某些反应，将孵育时间延长至12h，能够提高实验的灵敏度；
(4)洗3次，每次5min以上；
缓冲液中可以含1％TritonX-100或-40，以帮助解决背景问题。
(5)加入HRP标记的抗Ig抗体。这些试剂应购于有良好信誉的商业试剂公司。确认所选择的二抗是特异性针对一抗的种属来源。例如，一抗如果来源于兔，则羊抗兔Ig将是一个很好的选择。二抗应该用含蛋白质的溶液(如3％A／)进行稀释。供应商会建议合适的稀释度，但如果没有相关建议，可进行二抗稀释度测定，稀释度范围在1：10和1：1 000之间。
加入稀释液的竞争蛋白必须为非特异性抗体，其来源应与标记二抗一致，即同一种属的动物。例如，如果使用标记的羊抗兔Ig，则稀释液中须含1％的非免疫羊18(从非免疫动物中分离及纯化)。
(6)加入标记的二级试剂后在室温下孵育至少20min，但不应超过1h；
(7)用洗3次，每次5min以上。
(8)最后一次洗涤时，准备底物DAB。将6mgDAB溶于10ml 0．5mol／LTris缓冲液中(pH 7．6)，加lml 0．3％W／V的氯化镍储存液(或等量的氯化钴)；
加0．1ml的3％H202溶液。30％H202溶液较易获得，可置4℃保存1个月；
如出现沉淀，用Whatman 1#滤纸(或类似滤纸)过滤；
(9)将底物溶液加入样品。观察样品，在背景发生变化前出现适量黑色沉淀时终止反应。常为1～20min之间。在水中漂洗数次即可终止反应。
(10)加入DPX，用光学显微镜观察结果。