间接法是用未标记的一抗和标记有HRP的二级试剂，经过简单孵育后，进行酶促反应。将抗体直接加入细胞中就可以使一抗与细胞上的抗原结合，在加入不同抗体或同一抗体不同稀释度的溶液时，注意不要发生交叉污染，每一张盖玻片或样品管只能用于某一抗体溶液。抗体能够与相应抗原发生特异性结合，而未结合的抗体通过洗涤被去除，然后加入HRP标记的二级试剂，再经过洗涤后HRP酶促反应将在抗原—抗体结合的部位产生棕色沉淀。
1．HRP标记试剂
HRP标记的二级试剂通常用于低分辨率的研究，它可快速检测抗原的存在及位置。其主要优点为敏感性高、仅需光学显微镜即可观察等。
用于标记二级试剂的酶及其底物有数十种。考虑到价格，建议使用HRP及DAB来进行细胞染色。经过较长时间的孵育，HRP酶促反应作用强且呈线性变化。在多数可选底物中，DAB是最常用于HRP标记的试剂，而且也最为敏感。反应产物为深褐色，亦不溶于水和乙醇中。在底物溶液中加入钴、镍等金属盐可提高此法的敏感性，其反应产物为灰蓝色到黑色，亦不溶于水和乙醇中。这种产物易于照相或扫描，以便用于实验结果的保存和发表。
使用HRP酶标试剂时，稀释缓冲液及洗涤液均不应含有叠氮钠，因为即是微量的叠氮化合物也能灭活HRP酶的活性。一抗中加入的叠氮钠在经过洗涤后由于得到充分稀释，一般不会影响到后续的酶活性检测。
2．对照
每个实验至少需设两组对照：①加入同一种属、同一类型的无关抗体作为一抗以检测染色的特异性；②对照组不加一抗以检测标记二抗的背景；③如有可能，还应设置阳性对照。
3．准备工作
进行抗体结合和检测最重要的准备工作是一抗和二抗的滴度测定。虽然在下述技术方法中建议抗体的初始加入量，但在免疫染色中最大的问题是调整一抗、二抗的加入量使之产生有效信号，又避免非特异性染色。最好的办法是对每一种抗体(存在于蛋白质缓冲液中，如3％A／)作一系列稀释并观察其对靶细胞的效应。l／3稀释(1份体积中加入2份体积)将接近半对数期，能迅速合理地确定抗体加入的量。每次准备一抗时，都需重复滴度测定实验。然而，一旦确定了二级试剂的稀释度，就可以作为这一批抗体的标准。
4．所需溶液和特殊设备
一抗溶液；二抗溶液(多为商品化的HRP标记的抗Is抗体)；3％A／；DAB；0。05mol/LTris缓冲液；0．3％mg／ml氯化镍储存液，溶于蒸馏水中；30％H202；DPX；光学显微镜(带有照相机以记录结果)。
5．常见问题
几种方法可解决信号弱的问题。
(1)酶促反应中延长酶与底物孵育时间，这样可使酶与底物充分作用而产生强信号。
(2)提高一抗和二抗的浓度以增强敏感性，这必须测试多种浓度抗体的滴度。
(3)延长一抗和二抗的孵育时间。由于细胞染色中抗原吸附在固相载体上，抗原抗体结合所需时间较在溶液中长。孵育时间可作适当调整，但少于30min几乎不能有效结合。
在以上三点中，应摸索出一个最佳条件以产生有效信号且保持良好的背景。这就需要反复试验，因为每组抗体和抗原的情况会有所不同。
(4)换用荧光素标记的二级试剂，并用共聚焦显微镜，可大大提高敏感性。
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