聚合酶链反应[PCR]实验原理和操作步骤(2)

【实验目的】

了解聚合酶链反应（PCR）的基本原理及其影响因素，掌握PCR的基本操作过程。

[仪器]

PCR仪、台式离心机、电泳仪、电泳槽、紫外检测仪

[试剂]

1、引物：用去离子水配成10 μmol /μL。

2、Taq聚合酶

3、10×PCR反应缓冲液（加镁离子）

4、dNTPs：四种核苷酸混合物，浓度为10mM

5、模板：含有R基因片段的重组cDNA的质粒

6、1%琼脂糖凝胶

7、50 ×TAE电泳缓冲液(1000 mL)

Tris 242 g，Na2EDTA.2H2O 37.2 g， 溶于600 ml 去离子水中；加冰乙酸57.1 ml, 最后用去离子水定容至1000 mL。

8、6× 上样缓冲液

0.25% 溴酚蓝；0.25%二甲苯睛蓝，30%甘油，溶于水中，4℃保存。

[实验步骤]

1、反应混合液的配制：在一个0.5mlPCR管中加入下列成分：

充分混匀，离心片刻，使液体沉至管底。

实际操作时，先根据所需进行的反应数，配制反应混合物（按上述配方，不含模板）。每组进行3 个反应，需配制76微升反应混合物，则按上述配方的4倍进行配制。然后分装于4个PCR管中，每管19微升。其中3管每管加入1微升模板，另一管加入1微升水，作为对照。
2、PCR反应条件

循环1：94℃，3分钟；循环2-31：94℃变性45s、52℃退火45s、72℃延伸1min；共30个循环；最后72℃延伸10分钟。

3、反应结束后，取5微升反应产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳分析，其余置4℃保存备用。

（1）用1 x TAE缓冲液配制琼脂糖凝胶：在电子天平上准确称取琼脂糖0.2g，倒入100 ml三角瓶，加入20 mL缓冲液。

（2）微波炉上加热40S。

（3）待冷却至60℃左右时，加入1μL溴化乙啶，摇匀。

（4）将凝胶倒入预先准备好的制胶板上，插入梳子，待冷却。

（5）取5微升PCR产物在１％琼脂糖胶上电泳：80V，20min。

（6）取出凝胶，在紫外灯下观察，记录观察结果。　

3、PCR产物的纯化

（1）向PCR产物中加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25：24：1，v/v），混匀；

（2）14 000 r/m 离心5min；

（3）取上清液，再加等体积的酚/氯仿/异戊醇（25：24：1，v/v），混匀；

（4）14 000 r/m离心15 min；

（5）取上清液，加入1/10体积的3M NaAc (pH5.2)和2.5倍体积的无水乙醇，混匀，-20℃放置2 h或过夜。

（6）4℃，14 000 r/m离心15 min，弃上清液；

（7）沉淀用70%乙醇洗涤1次；

（8）14 000 r/m离心10 min，弃上清，风干。获得纯化的PCR产物。

[注意事项]

由于PCR灵敏度非常高，所以特别需要防止反应混合物受到DNA的污染，因此在实验中应注意下列事项：

1、所有与PCR有关的试剂，只作PCR实验专用，不得挪作它用。

2、操作中使用的PCR管、离心管、吸头等，只能一次性使用。

3、特别注意防止引物受到用同一引物扩增的DNA的污染。所有试剂，包括引物，应从母液中取一部分稀释成工作液以供平常使用，避免污染母液。