一、目的要求
1、掌握各种分离、接种方法。
2、掌握无菌操作基本环节。
二、实验说明
微生物在自然界中呈混杂状态存在，要获得所需菌种，必需从中把它们分离出来。在保存菌种时不慎受到到污染也需予以分纯。微生物分离和纯化的方法很多，但基本原理却是相似的，即将待分离的样品进行一定的稀释，并使微生物的细胞（或孢子）尽量以分散状态存在，然后使其长成一个个纯种单菌落。然而上述工作又离不开接种，即将一种微生物移到另一灭过菌的培养基上的过程。
三、实验材料
1、恒温培养箱。
2、接种环、玻璃棒、吸管、酒精灯。
3、培养基（上次实验配制的）。
4、大肠杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌。
四、方法步骤
（一）接种的操作
1、斜面接种（接金黄葡萄球菌）
（1）操作前，先用75%酒精擦手，待酒精挥发后点燃酒精灯。
（2）将菌种管和斜面握在左手大姆指和其它四指之间，使斜面和有菌种的一面向上，并处于水平位置。
（3）先将菌种和斜面的棉塞旋转一下，以便接种时便于拔出。
（4）左手拿接种环（如握钢笔一样），以火焰上先将环端烧红灭菌，然后将有可能伸入试管其余部位也过火灭菌（图7-1.1）。
（5）用右手的无名指、小指和手掌将菌种管和待接斜面试管的棉花塞或试管帽同时拔出（图7-1.2），然后让试管口缓缓过火灭菌（切勿烧过烫）。
（6）将灼烧过的接种环伸入菌种管内，接种环在试管内壁或未长菌苔的培养基上接触一下，让其充分冷却，然后轻轻刮取少许菌苔，再从菌种管内抽出接种环。
（7）迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管。从斜面底部向上作“Z”形来回密集划线。有时也可用接种针仅在培养基的中央拉一条线来作斜面接种，以便观察菌种的生长特点。（图7-1.3、4）。
（7）迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管。从斜面底部向上作“Z”形来回密集划线。有时也可用接种针仅在培养基的中央拉一条线来作斜面接种，以便观察菌种的生长特点。（图7-1.3、4）
（8）接种完毕后抽出接种环灼烧管口，塞上棉塞（图7-1.5、6）。
（9）将接种环烧红灭菌。放下接种环，再将棉花塞旋紧（图7-1.7）。
2、液体接种
（1）由斜面培养基接入液体培养基，此法用于观察细菌的生长特性和生化反应的测定，操作方法与前相同，但使试管口向上斜，以免培养液流出接入菌体后，使接种环和管内壁磨擦几下以利洗下环上菌体。接种后塞好棉塞将试管在手掌中轻轻敲打，使菌体充分分散（图7-2）。
（2）由液体培养基接种液体培养基，菌种是液体时，接处除用接种环外尚用无菌吸管或滴管。接种时只需在火焰旁拔出棉塞,将管口通过火焰,用无菌吸管吸取菌液注入培养液内,摇匀(图7-3、4)即可。
3、平板接种
将菌在平板上划线和涂布。
（1）划线接种 见分离划线法。
（2）涂布接种 用无菌吸管吸取菌液注入平板后，用灭菌的玻棒在平板表面作均匀涂布（图7-5）。
4、穿刺接种
把菌种接种到固体深层培养基中，此法用于嫌气性细菌接种或为鉴定细菌时观察生理性能用。
（1）操作方法与上述相同，但所用的接种针应挺直。
（2）将接种针自培养基中心刺入，直刺到接近管底，但勿穿透，然后尚原穿刺途径慢慢拔出（图7-6）。
（二）分离的操作方法
1、稀释分离法
通过不断稀释使被分离的样品分散到最低限度，然后吸取一定量注入平板与温度适合溶化了的琼脂培养基混合，这样分散的细菌被固定在原处而形成单菌落。
（1）将大肠杆菌或酵母菌用无菌水制作菌悬液。
（2）取若干支无菌试管，每支内盛9ml无菌水。
（3）吸取1ml制备好的菌悬液，置于第一支含有9ml无菌水的试管内，这样就稀释了10倍，也就是10-2。
（4）从第一支试管内（10-2）吸取1ml注入第二支含有无菌水的试管内，这样就稀释了100倍，也就是10-2。
（5）用同样方法操作，直至稀释至10-5-10-6。
（6）分别精确吸取10-5-10-6各稀释度菌液0.2ml加入编好号的空无菌平皿中，同一稀释度重复做三个平皿（图7-7）。
（7）将已溶化并冷却至45℃的琼脂培养基倒入上述各平皿内，轻轻旋转使培养基与菌悬液充分混匀，凝固后倒置于37℃或38℃度恒温箱中培养24-48小时，观察平板上菌落生长和分布情况。
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