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植物基因组DNA及总RNA提取技术-2

2020.9.07
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王辉

致力于为分析测试行业奉献终身

(二)植物总RNA提取
 (1)65°C水浴中预热15 mL CTAB提取液。
 (2)液氮中研磨2~3 g新鲜或-70°C冷冻的材料。
 (3)转移样品至有CTAB提取液的离心管中,立即激烈涡旋30s,短时放回 65°C水浴中(4~5 min)。
 (4)加入等体积的氯仿/异戊醇并涡旋混合,10000 rpm常温离心15 min。
 (5)将上清转移至一新离心管。重复抽提一次。
 (6)将上清转移至一新离心管中,加入 8 mol/L LiCl, 使LiCl的终浓度为2 mol·L-1,即加入1/3体积的LiCl,4°C下沉淀过夜(最多 16h)。
 (7)4°C离心1 h(全速),弃上清,用500 μL70%乙醇洗沉淀,然后用500 μL100% 乙醇洗沉淀。

(8)用500 μL SSTE 溶解沉淀,转移至1.5 mL离心管中,加入等体积的氯仿/异戊醇抽提一次。
 (9)加入2×体积的无水乙醇,在 -70°C沉淀30 min或-20°C沉淀2 h。
 (10)4°C离心20 min沉淀RNA(全速)。
 (11)先用400 μL70%乙醇洗沉淀,然后用400 μL100%乙醇洗沉淀,吹干后用65 μLDEPC水溶解RNA。
 电泳检测RNA:
 (1)配制1.2%的琼脂糖凝胶(20mL)
 称取琼脂糖0.24 g,加DEPC处理的ddH2O 12.04 mL,5×RNA 电泳缓冲液4 mL,电炉加热融化琼脂糖,冷却至55°C,加入甲醛1.96 mL,冷却后倒胶。
 (2)RNA电泳
 取去离子甲酰胺10 μL,甲醛1.5 μL,10× RNA Buffer 2 μL,RNA (2~4 μg, <10 μL) 混合液,65°C加热15min,迅速在冰浴中冷却片刻,然后加入3 μL RNA 加样缓冲液和0.5 μL EB,上样电泳。电泳Buffer 为1× RNA buffer。
 出现的电泳条带有两条,是两条最大的核糖体RNA(rRNA)分子,即18S 和28S rRNA,较小的RNA也很丰富但看不到,因为太小,跑出了凝胶的边界。多数细胞中的信使RNA(mRNA)经EB染色后不足以形成可见的带。只要18S 和28S rRNA带亮,且28S rRNA大约为18S rRNA 的两倍,说明提取的RNA没有发生降解,纯度好。

RNA提取有其他多种方法,整个流程下来所用时间不同,如专门的试剂盒Trizol可在1.5h内完成RNA的提取工作,但得率较低,适合草本类植物,木本类植物用CTAB法提取的RNA可在1.5d内完成,但得率高,此法可获大量的RNA用于Northern杂交、基因克隆等工作。
 (三)提取的DNA(RNA)的浓度检测
 (1)取少量待测DNA(RNA)样品,用TE或蒸馏水稀释50倍(或100 倍)。
 (2)用TE或蒸馏水做空白,在260 nm、280 nm、310 nm处调节紫外分光光度计的读数至零。
 (3)加入待测 DNA(RNA)样品在三个波长处读取OD值。
 (4) 纯DNA样品的OD260/OD280 大约为1.8,高于1.8可能有RNA污染,低于1.8有蛋白质污染;纯RNA 样品的OD260/OD280 大约为2.0。
 (5)根据OD值计算DNA(RNA)浓度或纯度。
 [SSDNA]=33×(OD260-OD310)× 稀释倍数
 [dSDNA]=50×(OD260-OD310)×稀释倍数
 [SSRNA]=40×(OD260-OD310)× 稀释倍数


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