纸层析是分配层析法的一种，其以滤纸为惰性载体，展层溶剂大多是由水饱和的有机溶剂组成。
滤纸纤维的—OH 基的亲水基团可吸附有机溶剂中的水作固定相，有机溶剂作流动相，当流动相沿滤纸自下向上展开，称为上行层析；反之，流动相自上向下移动，为下行层析。
纸层析法主要依据混合组分对两相分配系数的差异而进行分离的，同时也存在着某种程度的吸附作用和离子交换现象。
试样经层析后在滤纸上形成距原点不等的层析点，可用比移值(Rf)表示各组成成分的位置。
只要实验条件不变，对于某一样品成分Rf
值是一个常数，可用于定性分析。由于影响比移值的因素较多，因此一般采用在相同实验条件下对照物质对比以确定其异同。作为单体鉴别时，试样所显主色谱斑点的颜色(或荧光)与位置，应与对照(标准)样所显主色的谱斑点或供试品-对照品(1∶1)混合所显的主色谱斑点相同。作为质量指标(纯度)检查时，可取一定量的试样，经展开后，按各单体的规定，检视其所显杂质色谱斑点的个数或呈色(或荧光)的强度。作为含量测定时，可将色谱斑点剪下洗脱后，再用适宜的方法测定，也可用色谱扫描仪测定。
所用滤纸应质地均匀平整，具有一定机械强度，不含会影响色谱效果的杂质，也不与所用显色剂起作用，以免影响分离和鉴别效果。必要时可作特殊处理后再用。
(1)上行法
色谱缸一般为圆形或长方形玻璃缸，缸上有磨口玻璃盖，以便密闭。色谱滤纸一般长约
25cm，宽度则视需要而定，必要时可将色谱滤纸卷成筒形。点样基线距底边约2.5cm，可先用铅笔画出，再用微量吸管或微量注射器吸取溶剂，点于点样基线上，溶液宜分次点加，每次点加后，使其自然干燥、低温烘干或经温热气流吹干。样点直径一般不超过0.5cm，样点通常应为圆形。色谱缸内加入适量流动相，放置，待流动相蒸气饱和后，将点样后的色谱滤纸垂直浸入流动相约0.5cm，流动相即经毛细管作用沿色谱滤纸上升，除另有规定外，一般展开至15cm
后，取出晾干，按规定方法检视。
色谱可以向一个方向进行，即单向色谱；也可进行双向色谱，即先向一个方向展开，取出，待流动相完全挥发后，将滤纸转90°，再用原流动相或另一种流动相进行展。亦可多次展开，连续展或径向色谱等。
(2)下行法
所用色谱缸同上行法。在近缸顶端有一用支架架起的玻璃槽作为流动相的容器，槽内有一玻璃棒，用以支持色谱滤纸使其自然下垂，避免流动相沿滤纸与溶剂槽之间发生虹吸现象。
取适当的色谱滤纸按纤维长丝方向切成适当大小的纸条，离纸条上端适当的距离(使色谱纸上端能足够浸入溶剂槽内的流动相中，并使点样基线能在溶剂槽侧的玻璃支持棒下数厘米处)用铅笔划一点样基线，必要时色谱纸下端可切成锯齿形，以便于流动相滴下。将试样溶于适当的溶剂中，制成一定浓度的溶剂。用微量吸管或微量注射器吸取溶剂，点于点样基线上，溶液宜分次点加，每次点加后，使其自然干燥、低温烘干或经温热气流吹干。样点直径一般不超过0.5cm，样点通常应为圆形。将点样后的色谱滤纸上端放在溶剂槽内，并用玻璃棒压住，使色谱纸通过槽侧玻璃支持棒自然下垂，点样基线在支持棒下数厘米处。色谱开始前，色谱缸内用各单体中所规定的溶剂的蒸气饱和，一般可在色谱缸底部放一装有流动相的平皿，或将浸有流动相的滤纸条附着在色谱缸的内壁上，放置一定时间，俟溶剂挥发使缸内充满饱和蒸气。然后添加流动相，使浸没溶剂槽内滤纸，流动相即经毛细管作用沿滤纸移动进行展开至规定距离后，取出滤纸，标明流动相前沿位置，待]流动相挥散后按规定方法检出色谱斑点。
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