溶菌酶分离纯化及酶活力、蛋白浓度测定-1

一、实验目的和内容

目的：1. 通过本次实验的学习和操作，要求学生掌握离子层析的原理以及离子交换层析的操作方法；

2. 掌握离子交换树脂的再生和保存；

3．掌握比色法测定溶菌酶的酶活。

内容：采用离子交换层析对实验二获得的初提液，进行进一步的分离纯化以得到较高纯度的溶菌酶。具体来说包括：

1．离子交换层析分离纯化溶菌酶的操作过程：离子交换柱的装填、处理、平衡、上样、洗脱与再生以及保存；

2．溶菌酶的活性测定；

3．用标准曲线测定蛋白质浓度

二、实验仪器与试剂

1. 实验仪器：

分部收集器，核酸蛋白质检测仪，记录仪，高速离心机（可用50mL离心管），冰箱，可见光分光光度计、摇床、烧杯、玻璃棒、漏斗、滤纸

2. 实验材料及试剂：

　　样品S1、S2、S－2，CM-Sepharose F.F.，0.02mol/L pH8.0的PBS，0.5mol/L NaCl，烧杯（50mL，250mL）、枯草芽孢杆菌过夜培养物（37℃，18h，160r/min,100/250mL）、0.02mol/L pH8.0的PBS(测活缓冲液, 含50mmol/L NaCl), 0.02mol/L pH8.0的PBS(离子交换洗脱溶液，含0.5mol/L NaCl)

三、实验步骤

（一）溶菌酶的分离纯化

1. 装柱

取20mL CM-Sepharose FF，1.0*20cm层析柱，以0.02M PBS,pH8.0为缓冲液装柱。装柱方式与第一次课大家装填分子筛层析柱的方法一样。注意不能使树脂露出水面，因为树脂露于空气中，当加入溶液时，树脂间隙中会产生气抱，而使交换不完全。对于重复使用的填料，需要先冲3倍柱床体积蒸馏水，将保存用的乙醇洗脱出来。

2. 平衡

用泵将3倍柱床体积的0.02M PBS pH8.0过柱。这一步的作用是使得柱床体系的内外达到平衡与均一，以利后续目的蛋白的结合。

3. 上样

用泵将S－2样品泵入层析柱，经过一段时间之后，蛋白将通过离子交换的方式，与介质相互作用而挂柱。注意观察并记录280nm下吸收值的变化。

4. 冲平

用3～4cv 0.02mol/L pH8.0的PBS 洗涤离子交换柱至无穿透峰为止，流速约1.5mL/min。在吸收峰下降段留样S3，取约1mL于Ep管－20℃冻存备用)
5. 洗脱

用100mL含0.5mol/L NaCl的0.02mol/L pH8.0的PBS和100mL 0.02mol/L pH8.0的PBS进行梯度洗脱。

收集洗脱峰，记录洗脱时间和洗脱峰体积V4。取0.5mL清液并加入等量40％甘油于1mL Ep管中，制备2管，-20℃备用（留样S4）

6. 再生

用泵将2倍柱体积的2mol/L NaCl过柱，然后水洗4倍柱体积。

洗脱完成后，需要进行离子交换填料的再生处理。离子交换基团为一些盐所覆盖，影响下次的重复使用。因此，先用高浓度的盐将与介质结合紧密的杂质洗脱下来，然后再恢复其离子交换功能。对于CM-sepharose 而言，只需要用水过柱即可以使其离子交换功能得到恢复。

7. 保存

用泵将2倍柱体积的20%乙醇过柱。介质回收用于蛋白质分离纯化的介质多保存于液体中。保存时需加入一些抑菌剂，如叠氮化钠等。对于本介质，只需采用20%乙醇保存即可。

对于洗脱下来的样品，我们无法确证是否含有溶菌酶。因此需要进行监测。一般采取活性监测的方式。本实验中利用溶菌酶水解枯草芽孢杆菌细胞壁，使得枯草芽孢杆菌裂解，以595 nm下光吸收值的变化来确定溶菌酶所在的吸收峰。

（二）溶菌酶的活性测定

取6mL枯草芽孢杆菌的过夜培养物，3500rpm常温离心5分钟，弃上清，沉淀用6mL 0.02mol/L PBS缓冲液悬浮，利用可见光分光光度计测其OD595并记录（吸光度在0.5～1.0范围，如果读数过高可适当稀释）。比色皿编号见下表，其中1只加入PBS作为仪器调零空白，2作为对照，3、4用于平行测定然后取平均值），30s测定一次吸光度值，约 3min内至吸光度达到稳定。

在室温，以1号管为对照，每隔30s分别测定2、3、4在595nm的吸光度。（因仪器数量有限，请各组错开时间进行，确保仪器准备完毕才加入酶液）

观察悬液OD₅₉₅反应前后的变化。根据以下的酶活定义，测定溶菌酶S1～S4活性。其中活力单位（U）：酶在室温（25℃），pH8.0条件下，OD₆₅₀每分钟降低0.001为1个活力单位U。处理数据后完成下表：

四、注意事项

1．离子交换树脂再使用前需要再生，阴离子交换树脂以“碱酸碱”的顺序进行处理，阳离子交换树脂以“酸碱酸”的顺序进行处理和再生。装柱时要求粒度均匀，比较致密，柱床表面平整，柱中无裂缝，气泡和沟流的现象。