一、实验目的
1.熟悉亲和层析纯化蛋白质的的原理。
2.初步掌握亲和层析法纯化胰蛋白酶的方法步骤。
二、实验原理
亲和层析已经广泛应用于生物分子的分离和纯化，如结合蛋白、酶、抑制剂、抗原、抗体、激素、激素受体、糖蛋白、核酸及多糖类等，也可用于分离细胞、细胞器、病毒等。近十多年来，亲和层析发展十分迅速，尤其是对那些分离流程长、难度大、浓度低、杂质多，采用常规方法难以进行分离的生物分子来说，亲和层析显示出其独特的优越性。
亲和层析主要是根据生物分子与特定的固相化配基之间的亲和力而使生物分子得到分离。它是由吸附层析衍生、发展起来的分离技术。利用亲和层析载体固相化配基与亲和互补物之间通过范德华力、疏水力、静电力、氢键作用等发生专一性的结合而进行分离。这种有选择性地结合主要归结于固相化配基与亲和互补物二者之间的生物学特性和特异的化学结构以及空间构象。在亲和层析过程中，被纯化的生物分子在一定的条件下，选择性地结合到被共价偶联到不溶性载体上的配基上，然后改变原有的条件，如洗脱液的PH
值、离子强度、有机溶剂的浓度等，有选择性地从载体上把被分离物洗脱下来。通过亲和层析法分离的物质，其纯度、活性回收率及纯化倍数均较高。
亲和层析的载体要选用机械强度高、非特异性吸附少、水不溶性的、具有较多化学反应基团—羟基的多糖类介质，该载体在温和条件下与配基共价偶联，而又不影响配基及被分离物质原有的生物学特性。
1967年Porath 和Ernback
报道了采用溴化氰可将含有氨基的有机分子偶联到多糖基上，使得亲和层析技术向前推进了一大步。直到目前，溴化氰活化载体还是用得最多，效果最好的活化方法。1971年Porath
又报道了应用环氧氯丙烷在碱性条件下活化载体的方法，克服溴化氰由于剧毒给操作带来的不便，使活化载体的方法简便易行，亲和层析技术得到广泛的应用。
目前可用于活化载体的活化剂有几十种之多，但常用的是溴化氰、环氧氯丙烷、1．4—丁二醚、戌二醛等。采用环氧氯丙烷为活化剂，sepharose 4B 为载体，鸡卵类粘蛋白为配基可合成适用于分离胰蛋白酶的亲和吸附
剂。载体活化及偶联反应如下：
1. 环氧氯丙烷活化载体与配基偶联
2. 溴化氰活化载体与配基偶联
上述反应，除了氨基能偶联外，也能与巯基发生偶联反应。
另一种与配基的偶联方式是插入”手臂”。在亲和层析中如果要以一个小分子作为配基(如胺类)，而被分离物(亲相互补物)又是一个大分子，二者在结合过程中就会受到空间阻碍，影响结合效果。因此，必须在载体和配基之间引入一段”手臂”，即再接上一段有机分子，使载体上的配基向外扩展伸长以增强配基和互补物之间的接触面，减少空间位阻，提高亲和层析的结合效率。合成过程要经过载体活化，接”
臀”、活化及连接配基等操作步骤。
目前常用的载体是琼脂糖胶粒。它具有机械强度高、透性好、载体本身非特异性吸附少等优点。除此以外，其他可用作载体的材料还有纤维素、葡聚糖凝胶(SePhadex)、多孔硅胶、树脂等。但是它们都具有不同程度的非特异性吸附，因此目前使用的并不多。
首页
