一、实验目的
学习和掌握基因重组以及外源基因在大肠杆菌中诱导表达的方法。
二、实验原理
通过基因重组可将外源基因导入细胞,并使之进行扩增或表达。在生命科学的研究中,基因重组已经不仅是研究的目的(如基因工程的上游工程),而且日益成为一项重要的研究手段(如基因功能研究中将研究对象基因单独分离后重组,可以研究其表达、调控过程以及功能等),所以有着不可替代的地位。本实验通过最基本的流程进行重组操作,目的是使外源基因在大肠杆菌中进行表达;有条件的话,可以进行表达条件的优化,筛选出高效的稳定的表达工程菌。
外源基因(可通过PCR,化学合成或直接从自然材料中分离方法获得)被克隆在Lac启动子下游,与表达质粒载体连接构成重组体,经CaCl2法转化导入受体大肠杆菌细胞内。当培养基含有IPTG(异丙基硫代-β-D半乳糖)时,Lac启动子被诱导而启动其下游基因进行表达,从而在大肠杆菌细胞中产生外源基因产物。通过电泳可检测表达产物蛋白的存在并估计其表达量,也可以通过检测表达产物的生物活性从而了解产物的有效性。
三、材料、试剂及器具
1、材料
含外源基因片段的保存质粒
2、试剂
(1)染色液、脱色液、2×上样缓冲液等
(2)IPTC
(3)表达质粒载体
3、器具
蛋白质电泳用的聚丙烯酰胶凝胶电泳系统
四、实验内容
本实验可拆分小综合实验:(1)重组和检测;(2)诱导表达和表达产物的检测;(3)生物活性检测和高表达菌株的筛选
(一)重组
1、按实验39的方法用一种(或用两种不同的)限制性内切酶酶切表达载体;用同样的限制性内切酶酶切含外源基因片段的保存质粒,然后 回收外源基因片段(若提供的材料是可以直接使用的外源基因片段,则不需从质粒上切割、回收)。
回收方法:①1.5ml的大离心管内套一个小的0.5ml的离心管,小离心管底戳一小洞,然后填上少量的硅烷化的玻璃纤维。整个二连系统灭菌备用.
在紫外光照射下(注意防护),迅速从电泳凝胶上切下含所需的带,放入二连系统的小管内。稍戳碎琼脂凝胶,加入适量TE。反复冻融几次,使琼脂糖结构破坏释放DNA,并溶于TE中。离心使TE(含DNA)通过小孔进入大离心管内,而大部分琼脂糖被玻璃纤维阻隔在小离心管中。对打离心管中的溶液纯化处理可得所需的DNA片段。
2、连接表达载体和外源基因。
3、连接产物经灭活连接酶活性后转化大肠杆菌感受态细胞。
4、筛选并初步鉴定阳性重组子:根据转化子的辨别转化子与非转化子;快速筛选重组子。
5、对初筛的重组子做进一步检测。
(二)诱导表达
筛选到的阳性重组子菌株
↓
用LB培养基在37℃培养过夜
↓
以1%的比例接种至100ml的表达用培养基中
↓
37℃培养至OD≈0.7-0.8
↓
加入 50μl 1mol/L IPTG (终浓度0.5nmol/L)
↓
37℃,振摇培养一段时间
↓
4℃,低温离心,收集菌体备用
(三) SDS-PAGE检测蛋白
1、配制分离胶
①架好胶板,用1.5nm胶条在两边隔开,用夹子固定,并用封底胶封底约 1cm
表50-1不同浓度的凝胶的成分和用量 单位(ml)
凝胶浓度(%) |
7.5 | 10 | 12 | 15 | 18 | 20 |
双蒸水1.5mol/L |
9.6 | 8.1 | 6.7 | 4.7 | 2.7 | 1.5 |
Tris。 HCL(PH8.8) |
5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 |
10% (w/v) SDS |
0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 |
Acr/Bis(30%) |
5 | 6.65 | 8 | 12 | 12 | 13.2 |
TEMED |
10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
10%Aps |
0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 |
表50-2 4 %分离胶的配制成分
成分 | 用量 |
双蒸水 | 6.1ml |
0.5mol/L Tris。 HCL(PH6.8) | 2.5ml |
10% (w/v)SDS | 100μl |
Acr/Bis(30%) | 1.3ml |
TEMED | 10μl |
10%Aps | 50μl |
总体积 | 10ml |
②配制分离胶
根据被分离的外源蛋白的相对分子质量选择凝胶浓度,将所有成分混匀后加入两玻璃夹缝中,并小心在胶面上加入1cm蒸馏水,约40min,等胶自然凝聚后倾斜倒出蒸馏水,并在两玻璃夹缝中水平插入1.5mn的梳子(在胶面上加入蒸馏水称水封,其目的是保持胶面平整和防止空气进入,影响凝胶)。
2、 按表50-2配制4%的浓缩胶
所有成分混匀后加入到夹缝中,并没过梳齿,待凝固后小心拔出梳子,用 100μl微量注射器抽取电极缓冲液冲洗梳子拔出后的加样凹槽底部,清除未凝的丙烯酰胺。
3、样品制备
菌体样品与2×上样缓冲液1:1混匀,并在100℃沸水浴中保温3min- 5min,取出待用。
4、 电泳
(四)生物活性检测
(五)高表达菌株的筛选
五、注意事项
1、实验前必须查阅有关参考书籍和资料,写出可行的实验步骤,了解有关数据、配制剂和培养基、灭菌等后方可开始实验。
2、实验中使用有毒(如EB)时必须注意防护,勿将毒物污染实验人员、实验室等。