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PCR产物的电泳鉴定

2020.9.08
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王辉

致力于为分析测试行业奉献终身

一、准备工作
1、实验器具与材料:
(1)移液枪:10ul
(2)吸头:20ul
(3)吸头台:放置200ul和20ul的吸头一个
(4)三角烧瓶:50ml一个
(5)琼脂糖
2、实验器具的处理与准备
(1) 塑料制品:(包括吸头等)
送至高压3次,试验前将枪头放入吸头台。
(2)电泳板及电泳槽:
用自来水冲洗干净备用
3、试剂配制和准备:
(1) 电泳缓冲液(TAE):
先配制0.5mol/L,PH8.0的EDTA溶液:将37.2g EDTA-Na加入160ml蒸馏水中,在搅拌器上剧烈搅拌。在用NaOH调节溶液PH值至8.0(约需4gNaOH)。用蒸馏水定容至200ml。后送至高压灭菌。室温保存。
再配制50×TAE溶液:在400ml蒸馏水中溶解121g Tris碱,加入28.55ml冰乙酸和50ml 0.5ml/L EDTA溶液,再加蒸馏水定容至500ml,室温保存。
(2)琼脂糖溶液(1.0%):
50×TAE溶液取10ml,稀释成500ml,取50ml溶解0.5g琼脂糖,电炉上煮至沸腾,溶化的琼脂物冷却至60℃左右时加入 10mg/ml EB 5ul,充分混匀,将温热的凝胶倒入已置好梳子的电泳板中,在室温下放置45min左右后进行电泳。
(3)溴化乙锭(EB)(10mg/ml):
在20ml水中加入0.2g溴化乙锭,磁力搅拌数小时。然后用铝箔包裹容器或将溶液转移至棕色瓶中,室温保存。
(4)加样缓冲液(Loading Buffer)一般为6×Loading Buffer
二、电泳鉴定时注意事项:
佩戴一次性手套,避免皮肤接触EB。无路做胶还是电泳缓冲液尽量用新的,不要超过两周。
三、电泳步骤
1、50×TAE取10ml稀释成500ml,取50ml溶解0.5g琼脂糖。电炉上煮沸后加入EB 5ul。另外450ml TAE倒入电泳槽中。
2、用透明胶封闭电泳板,琼脂糖溶液冷却至温热时,倒入带梳子的电泳板中,冷却后,拔出梳子,放入电泳槽中。

3、加样:PCR Marker:1ul Marker+1ul Loading Buffer+4ul TAE混匀于塑料膜上,加入孔中。PCR样品:5ul 样品DNA+1ul Loading Buffer 混匀后依次加入孔中。
4、接上电源,电压120V,电流50mA进行电泳。
5、电泳约1小时后,紫外灯检测。


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