二、核酸电泳的指示剂与染色剂
【指示剂】
电泳过程中，常使用一种有颜色的标记物以指示样品的迁移过程，核酸电泳常用的指示剂有两种：溴酚兰，呈蓝紫色；二甲苯青，呈蓝色。溴酚蓝分子量为670道尔顿，在不同溶液凝胶中，迁移速度基本相同，其分子筛效应小，近似自由电泳。在0.6%、1%、2%的琼脂糖凝胶电泳中，溴酚蓝的迁移率分别与1kb
0.6kb
0.15kb的双链线性DNA片段大致相同。在5%的PAG和含7~8mol/L尿素PAG中，分别与65mer和35mer的寡聚核苷酸迁移率相同。
二甲苯青的分子量为554.6道尔顿，其荷电量比溴酚蓝少，在凝胶中迁移率比溴酚蓝慢，在0.1%琼脂糖凝胶电泳中迁移率相当于4kb的双链线性DNA片段。在5%的PAG和含7~8ml/L尿素PAG中迁移率分别相当与260mer和130mer的寡核苷酸。
指示剂一般加在电泳上样缓冲液中，为确保进入样品孔中，还需加入适量的蔗糖，甘油或聚蔗糖400以增加密度。
【染色剂】
电泳后，核酸需经染色才能显色出带型，常用以下核酸染色剂：
1、溴化乙锭（ethidium bromide, EB）
最常用的核酸荧光染料，可嵌入核酸双链的配对碱基之间，在紫外线激发下，发出桔红色荧光。EB-DNA复合物中的EB发出的荧光，比游离的凝胶中的EB发出的荧光强度大10倍，因此无需洗净背景即可清楚观察核酸带型。若EB背景太深，可将凝胶浸泡于1mmol/LMgSO4中1h或10mmol/L
MgCl2中5min，使非结合的EB褪色，这样可检查到10ng的DNA样品，EB也可用于检测单链DNA或RNA，但其对单链核酸的亲和力相对较小，荧光产率也相对较低。
在凝胶或电泳缓冲液中加入终浓度为0.5μg/ml的EB，染色可在电泳过程中进行，能随时观察核酸的迁移情况。但EB带正电荷，嵌入碱基后增加了核酸分子的刚性，使迁移率减慢，故不宜用于测定核酸分子量的大小，这时应在电泳后将凝胶浸入0.5μg/ml的EB水溶液中10min进行染色。EB见光易分解，应于4℃避光保存，
2、吖啶橙（acridine orange, AO）：
吖啶橙可嵌入双链核酸碱基对之间，在254nm紫外线激发下发出530nm的绿色荧光；还通过静电与单链核酸的磷酸基结合，在254nm紫外线激发下产生640nm的红色荧光。因此可区分单链和双链核酸，灵敏度分别为0.1μg和0.05μg。但吖啶橙的染色操作要求严格，应在22℃，0.01mol/L磷酸钠缓冲液（pH7.0）中避光浸泡30min，然后在搪瓷盘中用该缓冲剂4℃脱色过夜或22℃脱色1~2小时。
3、银（Ag+）试剂：
Ag+与核酸形成稳定复合物，然后用甲醛使Ag+还原成银颗粒。AgNO3等试剂可使聚丙烯酰胺凝胶上的单链，双链DNA及RNA都染成黑褐色。银染法的灵敏度比EB染色高200倍左右，比亚甲蓝染色高100~1000倍，在小于0.5mm厚的凝胶中，能检测出0.5ng的RNA，其缺点是专一性不强，能与蛋白质，去污剂反应也产生褐色，而且对DNA的染色定量不准确。银与DNA稳定结合，对DNA有破坏作用，不适于DNA片段回收的制备。
4、亚甲蓝（methylene blue）
可将RNA染成蓝色，但灵敏度不高，而且操作时间长。染色过程：胶浸泡于0.02%的亚甲蓝，10mmol/L Tris-Ac（pH8.3），4℃放置1~2h，用净水洗5~8h（反复换水），带型肉眼可见，最低检测量为250ng。
三、DNA的琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖主要从海洋植物琼脂中提取来的，为一种聚合线性分子，一般含有多糖、蛋白质和盐等杂质，杂质的含量每个厂商和批号的产品不尽相同。对DNA电泳迁移率的影响也不一样，经化学修饰后熔点降低的琼脂糖叫低熔点琼脂糖，其机械强度无明显变化，主要用于DNA的限制酶原位消化、DNA片段回收以及小DNA片段（10~500bP）的分离。琼脂糖凝胶的孔径取决于琼脂糖的浓度。
【原 理】
DNA分子带负电荷，在电场中受到电荷效应、分子筛效应向正极移动过程中，因DNA分子的大小及构象差别而呈现迁移位置上的差异，对于线形DNA分子，其电场中的迁移率与其分子量的对数值成反比，电泳时加溴化乙锭，其与DNA结合形成一种荧光络合物，在254~365nm紫外照射下可产生桔红色的荧光，可用于检测DNA。（此法可观察到凝胶中2ng的DNA）。如有必要可从凝胶回收DNA片段，用于分子克隆或探针标记等操作。琼脂糖可制成不同孔径的凝胶，分离DNA的范围广，约200bp~50kb。
【试剂与材料】
1、5×TBE 缓冲液（pH8.3）
89mmol/L Tris
89mmol/L 硼酸
2mmol/ L EDTA
2、0.5×TBE缓冲液（pH8.3）
3、溴化乙锭（EB）：5mg/ml
4、1~2%琼脂糖凝胶：琼脂糖1~2克加0.5×TBE缓冲液至100ml，于锥形瓶中水浴煮沸20~30min或微波炉加热熔解备用。
5、6×上样缓冲液：（4℃保存）
0.25%溴酚兰，0.25%二甲苯青FF，30%甘油溶于水中
6、DNA分子量标准
【操作步骤】
1、琼脂糖凝胶板的制备：将1~2%琼脂糖凝胶加热溶化均匀，冷却到60~70℃加EB至浓度0.5μg/ml，倒入封好的凝胶槽，厚度约3~5mm，在距底板0.5~1mm的位置放置样品梳，检查梳子齿间有无气泡，可用吸管小心吸出气泡，待冷却成形后取出梳子及隔板，放入水平电泳槽中，缓冲液淹没过胶1~2mm为止。
2、加样：样品中加1/5体积的上样缓冲液，混匀，取10~15μl加入凝胶点样孔中，同时要设立合适的DNA分子量标准物。
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