目的：
1、掌握用细胞破碎液裂解菌体细胞，并通过电泳的方法细胞中不同分子量质粒的方法；
2、从实验六的氨苄青霉素抗性转化子中筛选仅含一个拷贝目的基因的重组载体。
原理：
挑选8～10个白菌落接于平板过夜培养。利用破碎细胞缓冲液中的十二烷基硫酸纳（SDS）在37℃溶解膜蛋白，使细胞破裂，然后高速离心，将含有质粒DNA的上清夜直接进行上样、电泳和分离，理论上只要筛选的转化子足够多，即可找到仅含一个拷贝目的基因的重组质粒。
挑选8～10个白菌落接于平板过夜培养。利用破碎细胞缓冲液中的十二烷基硫酸纳（SDS）在37℃溶解膜蛋白，使细胞破裂，然后高速离心，将含有质粒DNA的上清夜直接进行上样、电泳和分离，理论上只要筛选的转化子足够多，即可找到仅含一个拷贝目的基因的重组质粒。
一、仪器
超净工作台；微量可调式移液器；振荡培养箱；离心机；电泳仪；恒温水溶箱
二、试剂
LB培养基、Cracking Gel缓冲液[1mol/L Tris-HCl(pH6.8)10ml，20%SDS 10ml，250mmol/L EDTA1.6ml，蔗糖27.2g，1.2%溴酚蓝1.67ml，加双蒸水至200ml。
三、步骤
1、挑取转化平板上的单菌接种于含相应抗生素的2ml LB中，37℃振荡培养至A590值为0.6～0.8。
2、取1ml菌液至1.5mlEppendorf管中，离心9000rpm×9min，去尽上清。
3、加入70µl Cracking Gel缓冲液，混匀后，37℃水浴30min以上。
4、离心15000rpm×15min。
5、吸取上清点样电泳，观察。
提示：
溴化乙锭含有一个可以嵌入堆积碱基之间的一个三环平面基团。它与DNA的结合几乎没有碱基序列特异性。在高离子强度的饱和溶液中，大约每2.5个碱基插入一个溴化乙锭分子。当染料分子插入后，其平面基团与螺旋的轴线垂直并通过范德华力与上下碱基相互作用。这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近，导致与DNA结合的染料呈现荧光，其荧光产率比游离溶液中染料有所增加。DNA吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料，而被结合的染料本身吸收302nm和366nm的光辐射。在这两种情况下，被吸收的能量在可见光谱红橙区的590nm处重新发射出来。由于溴化乙锭-DNA复合物的荧光产率比没有结合DNA的染料高出20～30倍，所以当凝胶中含有游离的溴化乙锭（0.5µg/ml）时，可以检测到少至10ng的DNA条带。
在该染料存在的情况下，线状DNA的电泳迁移率约降低15%，因此，当需要知道DNA片段的准确大小（如DNA限制酶酶切图谱的鉴定），凝胶应该在无EB情况下电泳，电泳结束后用EB染色。
由于溴化乙锭具有一定的毒性，实验结束后，应对含EB的溶液进行净化处理再行弃置，以避免污染环境和危害人体健康。
（1）对于EB含量大于0.5mg/ml的溶液，可如下处理：
①将EB溶液用水稀释至浓度低于0.5mg/ml；
②加入一倍体积的0.5mg/ml KMnO4,混匀，再加入等量的25mol/L HCl,混匀，至室温数小时；
③加入一倍体积的2.l5mol/L NaOH,混匀并废弃。
（2）EB含量小于0.5mg/ml 的溶液可如下处理：
①按1mg/ml的量加入活性炭，不时轻摇混匀，室温放置1h；
②用滤纸过滤并将活性炭与滤纸密封后丢弃。
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