（二）目的克隆的鉴定
经过初步筛选获得的阳性克隆，下一步必须对带有目的序列的克隆做进一步筛选和鉴定。鉴定一般有几种常用方法：（1）分子杂交；（2）免疫学检测；（3）DNA测序；（4）蛋白质活性筛选；（5）基因互补实验。
1. 分子杂交
核酸分子杂交有多种方法：原位杂交、点杂交及Southern杂交等。
原理：带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。如果彼此退火的核酸来自不同的生物有机体，那么如此形成的双链分子就叫做杂种核酸分子。能够杂交形成杂种分子的不同来源的DNA分子其亲缘关系较为密切；反之，其亲缘关系则比较疏远。因此DNA／DNA的杂交作用，可以用来检测特定生物有机体之间是否存在着亲缘关系，而形成DNA／DNA或DNA／RNA杂种分子的这种能力，可以用来揭示核酸片段中某一特定基因的位置。
核酸分子杂交实验包括如下两个不同的步骤：
•第一，将核酸样品转移到固体支持物滤膜上，这个过程特称为核酸印迹转移，主要的有电泳凝胶核酸印迹法、斑点和狭线印迹法、菌落和噬菌班印迹法；
•第二，是将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标记或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交。所以有时也称这类核酸杂交为印迹杂交。
2. 免疫学检测
免疫学检测的前体是需要有目的蛋白质，一般从纯化的蛋白质制备抗体。
原理：是细胞因子（或受体）与相应的特异性抗体（单克隆抗体或多克隆抗体）结合，通过同位素、荧光或酶等标记技术加以放大和显示，从而定性或定量显示细胞因子（或受体）的水平。这类方法的优点是实验周期短，少受抑制物或相似生物池功能因子的干扰，如抗体的特异性高可区分不同型或亚型的细胞因子（如ifn），一次能检测大量标本，易标准化。与生物学活性检测方法相比，免疫学检测法在许多情况下敏感性低于前者，所得结果不表示生物学活性，有的mcab只能识别重组的细胞因子，在检测天然的细胞因
子中受到限制。
如：
ELISA是酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay
)的简称。它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。此项技术自70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。
原理
ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。
操作步骤：（1）克隆载体表达的蛋白与固相支持物结合；（2）加入目的蛋白特异的第一抗体，洗去未结合的抗体；（3）加入二抗，二抗分子偶连有标记酶；（4）加入无色底物；（5）对酶反应产物进行观察。
3. 蛋白质活性和功能互补筛选
DNA杂交和免疫检测对于多数基因和基因产物都是有效的。蛋白质活性作为克隆的指示标记有一定的难度。如果筛选的目的蛋白是一种酶，也可以根据酶对底物的反应来设计克隆的检测。
功能互补法：该方法要求被转化的宿主细胞是某一特定基因的缺陷株，携带来自野生型基因DNA的质粒，在宿主细胞中能与缺陷基因互补，最终选择具有正常功能的转化细胞。
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