对于大的基因组，DNA酶切图谱凭肉眼是分辨不开的（EB染色），因为大小不等的分子呈现弥散分布，只有借助灵敏的放射性同位素（或其他化学发光物质），将靶DNA在凝胶上（膜上）的带型通过特定的探针与之杂交，转换成X光片上直观的带型，才能进行相关分析。另外如果需要鉴定或寻找与已知DNA同源的 DNA片段如：染色体步查、基因组文库的评价和利用、阳性克隆的分析鉴定、转基因拷贝数分析等也都需进行DNA的分子杂交实验。
实验目的：
掌握同位素的操作及防护方法；掌握预杂交、探针的标记及分子杂交技术
实验原理：
依据碱基配对原则，用放射性同位素标记的DNA探针，与固着在膜上的靶DNA杂交，经放射自显影，确定靶DNA的位置。
1．预杂交：膜上有许多没有结合DNA分子的地方，若不在杂交前用一些封闭剂结合位点，加入探针后，探针DNA分子将会结合在这些位点上，导致杂交背景深，预杂交的目的是用非特异性DNA分子（鲑精DNA）及其它高分子化合物（封闭剂）将待杂交膜中的非特异性位点封闭，从而减少杂交背景。
2．探针的标记：体外标记DNA或RNA的方法有多种，如：末端标记，随机引物标记，缺刻平移（nick translation），体外转录（in vitro transcription）及各类PCR等。这些方法有的是在特定位置标记核酸（5’或3’末端），有的标记核酸分子内部的多个位点。有的产物是标记单链，有的产物是标记双链。有的方法产生一定长度的标记产物，有的得到的是长短不一的标记产物。
随机引物标记：在DNA聚合酶的作用下，寡核苷酸通过与单链的模板配对可以启动DNA的合成。如果寡核苷酸序列是不同的（heterogeneous），引物中包含所有可能的随机序列（如6碱基引物则有46=4096种），可以与任意模板序列相配对在许多位置形成杂交链，四种核苷酸底物中有一种是用同位素标记的，因而可产生均匀一致高比活放射性探针。同位素标记的探针DNA
的平均长度与引物的浓度成反比， The klenow fragment去除了 E．Coli DNA polymerase I 的5’→
3’的外切酶活性，具有5’→ 3’的聚合酶活性及3’→ 5’ 外切酶活性；
Primer：可通过用DNase I消化牛胸腺DNA，DNA合成仪合成或直接从公司购买。同位素标记的探针DNA的平均长度与引物的浓度成反比 [=k/(lnPc)1/2， Pc是引物的浓度]，一般可产生约400-600 bp的标记产物。
模板DNA：线状双连DNA。环状 DNA用限制性内切酶切成线状，再标记。用纯化的DNA片段作模板标记的探针与用完整的质粒作模板比较，可减少背景。
dNTPs： 其中一种用放射性同位素标记
3．杂交： 将标记好的探针，加到杂交液中，在一定（温度下）条件下，使探针与膜上的DNA杂交。
4．洗膜：用不同组成及离子强度的（严谨度）溶液，洗去膜上的封闭剂及非特异性杂交的探针
实验材料及试剂：已转移上DNA的尼龙膜，32P标记的dCTP，随机引物，20×SSC，10%SDS，X-光片，显影液及定影液等
实验步骤：
1.预杂交：将尼龙膜在2×SSC中浸湿，放入杂交袋或杂交管中，加入适量杂交液（杂交液浸没膜），赶气泡，封口，放入65℃的杂交箱或恒温摇床中，预杂交3个小时以上，一般6-12hrs。
2. 标记探针：
首页
