（1）过夜培养的宿主细胞(如NM522或JM101)用3ml TYP肉汁培养基以1:100稀释。在37℃强烈震荡1小时之后，细胞进入对数早期。此时，将一个合适的含有重组M13的噬菌斑(连同琼脂)用滴管转入该细胞培养液中。

（2）37℃强烈震荡(300rpm) 培养6小时。

（3）把细胞培养液转入两只1.5ml eppendorf管，12000g离心15分钟。上清液转移到新的eppendorf管再离心15分钟。小心地取出1-1.2ml上清液(注意不能触及沉淀)，再转到新的eppendorf管。 .

（4）将0.25体积的含20%PEG(-8000)的3.75M醋酸铵(pH7.5)加入上清液以沉淀噬菌体。混匀后置冰上30分钟，再以 12000g离心15分钟，倾去上清液，再以同样方法离心一次，用吸液器尖头将残留的PEG充分吸干净。此时应能见管底有芝麻大小的噬菌体颗粒沉淀。

（5）将沉淀物重溶于400ml TE缓冲液中。

（6）加等体积氯仿/异戊醇(24:1)混合液，强烈震荡1分钟，12000g离心5分钟。

（7）将水相转入一新的eppendorf管，注意不能触动原管中两相交界面。加等体积苯酚/氯仿(1:1)混合液，强烈振荡1分钟，12000g 离心5分钟。

（8）将上层水相转入另一新的eppendorf管，重复第7步的提取，如有必要重复多次直至二相之间无可见物质存在。

（9）将上层水相转入一新的eppendorf管，加等体积氯仿，强烈振荡1分钟后，12000g离心5分钟，多次重复此步骤。

（10）将上层水相转入新的eppendorf管，加0.5倍体积的7.5 mol/L 醋酸铵，2倍体积乙醇，混匀后-20℃放置 30分钟。

（11）12000g离心15分钟，去除上清液，用70%乙醇小心清洗沉淀，如果沉淀已被搅起，重新离心，倾去酒精，真空干燥沉淀物。

（12）将DNA 的沉淀物溶解于20ml去离子水中，取2ml样品进行琼脂糖凝胶电泳定量，如果DNA 量充足，则可进行退火测序。

2、噬粒(Phagemid)单链模板的制备：

噬粒是指含有丝状单链DNA 噬菌体复制区的嵌合质粒。分子克隆中常用的pBluescript系列和pGEM系列的质粒均属噬粒。含重组噬粒的细胞单菌落经液体培养并用辅助噬菌体超感染后就能产生测序反应所需的单链DNA 模板。

（1）从新鲜平板上挑得含pGEM质粒DNA 的抗Amp单菌落，并接种到100ml含有50mg/ml氨苄的TYP肉汤培养基中，在37℃振荡过夜。

（2）取100ml过夜培养物接种到另一新的装有5ml 含50mg/mlAmp的TYP肉汁培养基的试管中，在37℃强烈振荡30分钟。

（3）加40μl辅助噬菌体R408或M13 K07，继续剧烈搅拌振荡培养6-8小时，使辅助噬菌体超感染。

（4）12000g离心15分钟后，去除沉淀，取上清，转移到一新eppendorf管中再次离心15分钟，小心地取1-1.2ml上清液(注意不能触及沉淀)。

（5）将0.25体积的含20% PEG-的3.75M醋酸铵加入上清液以沉淀噬菌体颗粒。混匀后置冰上30分钟，再以12000g离心15分钟，倾去上清液，再以同样方法离心一次，用移液器尖头将残留的PEG溶液吸净。此时应能看到管底有芝麻大小的噬菌体颗粒沉淀。

（6）将沉淀物溶解于400ml TE缓冲液(10mmol/L Tris-HCl pH8.0，1mmol/L EDTA)。

（7）加等体积氯仿/异戊醇(24:1)混合液，强烈振荡1分钟，再以12000g离心5分钟。

（8）将水相转入一干净eppendorf管(不要触动原管中两相交界面)，加等体积酚/氯仿(1:1)混合液，强烈振荡1分钟，12000g离心 5分钟。

（9）上层水相转入一干净eppendorf管重复第8步骤提取，如有必要重复多次直至二相之间无可见物质。

（10）将上层水相转入一干净eppendorf管加等体积氯仿，强烈振荡1分钟后离心，多次重复此步骤。

（11）将上层水相转入一干净eppendorf管加0.5倍体积7.5mol/L pH7.5醋酸铵，再加2倍体积乙醇，混和后-20℃放置30分钟。

（12）12000g离心15分钟，去除上清液，用70%乙醇小心清洗沉淀，如沉淀已被搅起，重新离心，倾去乙醇，真空干燥沉淀。

（13）将沉淀物溶解于20ml去离子水中，取2ml样品进行琼脂糖凝胶电泳进行定量，如果DNA 量充足，则进行退火和测序。