核酸探针是指能与特定核酸序列发生特异性互补的寡核苷酸链。核酸探针有双链DNA探针、单链DNA
探针、RNA探针和寡核苷酸探针。特异性探针来源于目的核酸的酶切片断、dd-PCR等差异显示中出现的差异片断、AFLP、RFLP、RAPD、SSR、CFLP等标记实验中出现的特异性基因标记片断。可以通过人工合成、酶切、PCR等手段富集探针。探针必须带上标记才能有用,不带标记的探针称为裸探针。探针标记是进行杂交及一些分子标记研究的前提。探针标记有单链标记、双链标记、直接标记及间接标记,放射性标记和非放标记。本实验主要介绍非放标记。目前国内外使用的非放标记主要有光敏生物素标记、地高辛标记及ECL直接化学发光标记等。
1光敏生物素对探针的标记
在强可见光的照射下,光敏生物素中的N3基团光解放出N2,生成反应活性极高的氮烯;N基团,易与核酸碱基中的伯胺基结合而形成共价标记。核酸中每100-150个碱基可结合一个生物素。
一:仪器:光标记灯离心机
二:试剂
光敏素试剂盒
光敏素试剂醋酸盐
亲和素-碱性磷酸酶检测系统
亲和素-碱性磷酸酶
BCIP(实验时10mg溶于200μlDMF中)
NBT(实验时15mg溶于200μl70%DMF中)
二甲基甲酰胺(DMF),仲丁醇, 3MNaAC无水乙醇
三:操作
(一)核酸探针的光敏素标记
1:在一支灭菌的Eppendof离心管中加入20μl探针DNA(0.5-1μg/μl,溶解于水中
2:避光条件下加等体积的光敏生物素醋酸盐并混匀。
3:将装有反应液的离心管置于冰模中,暗室中在光标记灯下照射30分钟(灯距样品15cm)。
4:加入无菌水至总体积为100μl
5:加入100μl仲丁醇,混匀。10000rpm离心10min,去上层液,再加入仲丁醇,离心,使水相浓缩至30-40μl。
6:加入4μl的3M NaAC,混匀,再加入2体积的预冷无水乙醇,混匀,-20℃过夜或-70℃15min
7:4℃15000rpm 离心15min,取桔红色沉淀。
8:真空干燥,沉淀溶于无菌水中。
注:1仲丁醇与水能部分互溶,因此最好先用水将其饱和,以防DNA丢失,如不饱和则可起到浓缩水相的作用,
2:买来的或要来的探针一般都保存在TE缓冲液中,因此在使用前脱盐,否则光敏素与Tris反应,使电泳条带拖尾。
3:在沉淀探针时,NaAC能不加,尽量不加。沉淀离心是最好在低温下进行,
2地高辛对探针的标记
带有地高辛标记的dUTP(图14-1)通过缺口翻译、随机翻译或PCR等反应而使探针核酸片段带有地高辛,进一步可与带有AP、CSP等各种抗地高辛抗体复合物发生免疫反应,使探针上带有AP等分钟,进一步能催化化学或发光反应。图14-2为各种DIG标记探针及检测类型汇总;图14-3为DIG标记探针的方法;图14-5为标记探针应用;图14-4为DIG标记探针的检测方法。
图14-1DIG标记dUTP结构图
图14-2:DIG标记图示
图14-3DIG标记探针方法
本实验拟通过随机引物及PCR方法,将DNA探针片段用DIG标记,进一步掌握探针的标记技术。
随机引物法标记DIG探针
1:1ug(10ng <DNA探针量<3ug)待标记DNA溶于16ul水中,在沸水浴10分钟变性,迅速放于冰浴(NaCl或乙醇冰浴)冷却。
2:在冰浴上,上述管中加入4ulDIG-HIGH-Prime混合物(含5×反应缓冲液、50%甘油、各1mM的dATP,dCTP,dGTP,0.65mM的dTTP及0.35mM的DIG-dUTP ,1U/ulKlenow酶)。
3:离心混合,3760分钟或过夜
4:加2ul0.2MEDTA(pH8.0)或65℃10min终止反应。
5:在上述20/22ul反应体系中加入2.5ul4MliCl,75ul(-20℃预冷)乙醇沉淀,70%乙醇洗沉淀,真空干燥,复溶于少量PH8.0TE中,-20℃保存(忌讳反复冻融)。
3:ECL方法对探针的标记