基因的翻译表达-1

1体外TNTRT7 转录/翻译系统表达重组基因

体外翻译是研究基因表达、基因调控的一类重要技术，该技术可广泛用于基因表达量、启动序列等调控因子的确立，并结合PTT实验筛选天然突变或人工诱变的基因片段，还可用来进行蛋白和DNA结合方面的研究。早期的体外翻译研究大多是提取mRNA然后通过网织红细胞或麦胚系统进行蛋白质表达。但目前的转录－翻译系统倾向于将RNA合成酶、核苷酸、缓冲液、RNA酶抑制剂网织红细胞裂解液混合成复合物，实现从DNA基因片段－蛋白质的全过程。Promega公司的TNTRT7 转录/翻译偶联快速系统即给研究人员提供了这种方便快速的研究真核基因表达的方法。 TNTRT7 转录/翻译 偶联快速系统使得真核细胞的体外翻译实验更简单,时间更短。对于大多数真核基因讲来,该系统在90分钟内即可合成2-6fold的蛋白比传统的网织红细胞裂解物翻译系统高的多。 TNTRT7 转录/翻译 偶联快速系统适合于研究由克隆到T7RNA聚合酶下游的基因编码的单一结构分子(蛋氨酸缺乏)的转录和翻译。用此系统时,0.2-2微克环状或现状DNA分子(如PCR扩增片断)加到TNTRT7 转录/翻译偶联快速系统的混合液中(50微升)在30℃保温60-90分钟,然后用SDS-PAGE或放射自显影分析反应物。本实验即以克隆到T7RNA启动子下的编码荧光素酶基因为材料，通过TNTRT7 转录/翻译 偶联快速系统实现荧光素酶基因的体外表达。

一:仪器：控温仪、取液器

二:试剂: TNTRT7 转录/翻译、偶联快速系统试剂盒、蛋氨酸、1mM

三:操作

1从-70℃中将 TNTRT7混合液取出,用手温融化,迅速放于冰浴,试剂盒中的其他试剂室温融化后,放于冰浴。

2:在一离心管中依次加入

TNTRT7混合液 40μl,

S-蛋氨酸2μl,

DNA模板1μg

无核酶水到50μl

用枪吸打混匀。

3:30℃保温60-90分钟

4:翻译酶蛋白活性检测或其他性质分析,放射自显影或SDS-PAGE分析结果。

2：基因的诱导表达及表达产物的分离

蛋白质是基因产物，在进行基因功能研究、转基因表达产物鉴定及利用工程菌株生产功能蛋白时都牵涉到外源基因产物的表达。目前基因产物的表达主要是将待表达基因构建到表达载体的特定启动子下游的多克隆位点，然后将重组载体转化或转染受体材料，人工培养并诱导激活启动子，使外源基因产物得以表达。受体材料主要有细菌、昆虫、噬菌体及动物细胞等，相对于特定的材料有特定的载体。表达方式主要有融合和非融合表达，启动子诱导有物理（如热）和化学（如IPTG）诱导。非融合表达是在载体的启动子与外源基因的起始密码之间不存在任何阅读框架，表达产物即为特定的外源基因产物；融合表达是载体启动子与外源基因的起始密码之间有阅读框架，翻译产物的起始密码来自于载体，外源基因是载体阅读框架的延伸，因此翻译产物是载体蛋白与外源基因产物的融合体。由于目前融合表达产物中来自于载体部分的蛋白常充当分离过程中的靶蛋白，因此该方法有利于纯化表达产物。

本实验即通过融合和非融合原核表达载体的利用，学习基因的诱导表达技术。

一非融合表达

仪器：摇床、培养箱、超净台

材料及试剂：载体为Pet-5a(如图17－1)，菌株为BL21（DE3），诱导剂为IPTG。