实验原理：
1、SNP的概念及意义
单核苷酸多态性（single nucleotide
polymorphism，SNP），主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。占所有已知多态性的90%以上。SNP在群体中的发生频率不小于1%。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，目前已发现约400万个SNP遗传标记。
SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换（transition）[指同型碱基之间的转换，如嘌呤与嘌呤( G-A)
、嘧啶与嘧啶( T-C) 间的替换]或颠换（transversion）[指发生在嘌呤与嘧啶(A-T、A-C、C-G、G-T)
之间的替换]所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。但通常所说的SNP并不包括后两种情况。理论上讲，SNP既可能是二等位多态性，也可能是3个或4个等位多态性，但实际上，后两者非常少见，几乎可以忽略。因此，通常所说的SNP都是二等位多态性的。
SNP变异可能是转换（C→T，在其互补链上则为G→A），也可能是颠换（C→A，G→T，C→G，A→T）。转换的发生率总是明显高于其它几种变异，具有转换型变异的SNP约占2/3，其它几种变异的发生几率相似。转换已C→T为主（图27-1），其原因是CpG的C是甲基化的，容易自发脱氨基形成胸腺嘧啶T，CpG
也因此变为突变热点。
图27-1
根据人类基因组的研究资料，DNA的核苷酸序列在不同个体中至少有99.9％是相同的；但在任意选定的两个个体中，DNA序列可以有数以百万计的变异点，其中绝大多数都属于SNP。SNP是人类基因组DNA序列中最常见的变异形式。据估计，发生在基因的蛋白质编
码区的约4万个SNP，可以导致蛋白质合成时氨基酸的“错义”改变。现已知，至少93％的人类基因都存在SNP。人类基因组SNP研究所揭示的人种、人群和个体之间DNA序列的差异以及这些差异所表现的意义将对疾病的诊断、治疗和预防带来革命性的变化。
SNP被称为“第三代DNA遗传标记”。这种遗传标记的特点是单个碱基的置换，与第一代的RFLP及第二代的STR以长度的差异作为遗传标记的特点截然不同。SNP的分布密集，在人类基因组中被认为有300万个以上的SNP遗传标记，这可能达到了人类基因组多态位点数目的极限，因此被认为是应用前景最好的遗传标记物。
2、SNP检测方法
传统的SNP检测方法是采用一些已有的成熟技术，如DNA测序、限制性酶切片段长度多态性(RFLP)、单链构象多态性(SSCP)、变性梯度凝胶电泳分析（DGGE），温度梯度凝胶电泳(TGGE)、等位基因特异的寡聚核苷酸杂交(ASO)、等位基因特异聚合酶链反应分析（AS-PCR）等。但这些必须通过凝胶电泳进行检测，因此，距快速、高效、自动化的目标还相差甚远。传统的RFLP只能检测到SNP的一部分，测序技术既费时费力，又不易实现自动化，不适宜于SNP的检测；SSCP则很难满足自动化的需要，难以大规模开展工作。因此，这些方法均未被广泛采用。目前已有多种新兴的方法可用于SNP检测，如变性的高效液相色谱检测(DHPLC)、等位基因特异性延伸（allele-specific
primer extension，ASPE）、单碱基延伸（single base
extension，SBE）技术、DNA列阵微测序法、动态等位基因特异的杂交、寡聚核苷酸特异的连接（OLA）、TaqMan探针技术、分子信标（molecular
beacons）技术、Minisequencing、DNA芯片等。其中基因芯片技术具有高通量、简便快捷、平行化和成本低廉等优点，且芯片技术的高密度探针矩阵可为大规模SNP分型提供一个高效检测途径。芯片技术平台包括微球微点阵，纤维薄膜微点、玻璃片基微点阵芯片等，其探针密度跨越范围几百至上百万不等，其中GoldenGateTM所使用的微球芯片密度可达100万，Affymetrix
SNP芯片密度近200万。
DNA芯片技术是近年来新开发的一种DNA序列变异检测工具。DNA芯片(DNA
chip)，也称生物芯片(biochip)，其大小与计算机上的CPU芯片相似，约1cm2或更大些，以玻璃、硅、聚丙烯等作为载体基片，芯片上铺了一层肉眼看不见的DNA纤维“地毯”，即具有特定碱基序列的探针。待测基因经提取后，被切成长短不一的片段，经荧光化学物质标记后，注射到嵌有芯片的载片上。由于DNA和探针杂交的程度与荧光强度相关，因此通过激光扫描，即可根据荧光强弱测出被检测序列的变异。
目前，基于DNA芯片的SNP检测平台以及功能成为高通量、大规模、全基因组SNP检测分析的主流技术。其中典型的代表是Affymetrix公司的SNP检测高密度DNA微阵列芯片。此外，还有Illumina公司的SNP检测芯片，如Beadlab平台，是Illumina公司整合GoldenGate多通道位点特异性延伸扩增检测方案和BeadArray高密度微阵列技术，开发而成的顶级高通量SNP基因分型系统，每天可完成超过44万个基因分型。
新的Affymetrix Genome-Wide SNP Array
6.0（图27-2）产品的特点是超过1,800,000个遗传变异标志物，包括超过906,600个SNP和超过946,000个用于检测拷贝数变化的探针。大约有482,000个SNPs来自于前代产品500K和SNP5.0芯片。剩下424,000s个SNP包括了来源于国际HapMap计划中的标签SNPs，X，Y染色体和线粒体上更具代表性的SNPs，以及来自于重组热点区域和500K芯片设计完成后新加入dbSNP数据库的SNPs。SNP6.0还包括了202,000个用于检测5,677个已知拷贝数变异区域的探针，这些区域来源的于多伦多基因组变异体数据库。该数据库中的每个3,182个非重叠片断区域分别平均用61个探针来检测。除了检测这些已知的拷贝数多态区域，还有超过744,000个探针平均分配到整个基因组上，用来发现求知的拷贝数变异区域。设计方面SNP
6.0芯片只取最佳SNP位点和每组等到位基因的一个完全匹配，并有三次重复检测，所以总共只有六个探针（表22-1）。
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