1、 包埋后染色 (超薄切片的金标记法)
（1）超薄切片厚50～70nm左右，载于200～300网孔的镍网上；
（2）滴1%的H2O2液1滴于蜡板上，将网的载片面轻浮于液滴上10min至1h；
（3）双蒸水洗3次，每次10分钟。第1、2次洗法如（2），浮于液面上，第3次以盛双蒸水的注射器沿镍网面冲洗，水流应有适当压力，但不易过强。用滤纸在网缘将水吸干；
（4）浮于正常羊血清（1：50～1：100）滴上，室温 30～60min，以饱和固定剂中的游离醛基和占据非特异性结合部位；
（5）PBS漂洗3min，洗一次（有人主张不洗）；
（6）滤纸吸干，孵育于第一抗体血清滴上，先室温1h，再置于4℃ 24～36h；
（7）PBS漂洗3次，每次3min；
（8）置网于PBS（含1% 的牛血清白蛋白 pH8.2）中，5min。此步为与胶体金结合做准备；
（9）置网于胶体金标记抗体液1：30～1：100，淡红色为适宜稀释度，室温，1min～1h；
（10）双蒸水洗3次，每次3min。
如作双重染色，则应将镍网翻过来，在另一面，用另一类抗体血清，重复上述步骤（2）～（10）；
（11）5%醋酸铀（双蒸水配制），染色5min，双蒸水洗净；
（12）枸橼酸铅染色5min，双蒸水洗净；
（13）电镜观察。
2、包埋前染色
（1）组织经过适当固定，为增强细胞穿透性，可在固定液中加入皂角素，使其浓度为0.01%，经含皂角液固定剂处理5～8min后，用0.01mol/L PBS pH7.4冲洗12h左右，中间换洗3～4次；
（2）组织切片贴于明胶涂抹的波片上，细胞可制成混悬液，用离心法操作或制成涂片；
（3）0.05mol/L TBS pH7.4洗3min；
（4）以1：5正常羊血清处理切片 30min，室温，以阻断非特异性吸附；
（5）一抗4℃孵育20h后室温2h或过夜；
（6）0.05%mol/L TBS pH7.4洗3min，3次；
（7）0.02%mol/L TBS pH8.2洗3min，3次，为与胶体金结合作准备；
（8）再次阻断非特异性吸附，同（4）；
（9）以金标记的二抗（工作浓度为1：40左右）在室温下孵育1h；
（10）0.02%mol/L TBS pH8.2洗3min
（11）0.05%mol/L TBS pH7.4洗3min，3次；
（12）1%锇酸（0.1mol/L PBS）1h；
（13）双蒸水洗15min；
（14）常规脱水包埋，超薄切片；
（15）枸橼酸铅对照染色。
首页
