金免疫层析试验

      1．原理
　　 金免疫层析试验（dot immunogold chromatographic assay，DICA）是用胶体金标记技术和蛋白质层析技术结合的以微孔滤膜为载体的快速的固相膜免疫分析技术。本项技是将各种反应试剂分点固定在试纸条上，检测标本加在试纸条的一端，通过毛细血管作用使样品溶液在层析材料上泳动，样本中的待测物与层析材料中的反应试剂发生特异性结合反应，形成的复合物被富集或固定在层析条上的特定区域（检测线），通过标记免疫技术显色。本项技术的特点是可进行单份标本检测且简便、快速、不需任何仪器设备，因此，发展非常迅速。
　　2.方法学类型
　　DICA多用于检测抗原，但亦可用于检测抗体。常见方法学类型有：
　　1)双抗体夹心法测抗原：
若图-2所示，G处为金标抗体(免疫金)，T处包被抗体，C处包被抗金标抗体，B处为吸水纸。测试时A端滴加待测标本，通过层析作用，待测标本向B端移动，流经G处时将金标抗体复溶，若待测标本中含待测抗原，即形成金标抗体-抗原复合物，移至T区时，形成金标抗体-抗原-抗体复合物，金标抗体被固定下来，在T区显示红色线条，呈阳性反应，多余的金标记抗体移至C区被抗金标抗体捕获，呈现红色质控线条。
　　　　　　　　　　　　
　　图-2免疫层析试验双抗体夹心法测大分子抗原
　　2）竞争法测小分子抗原：
若图1-3所示,G处为金标抗体，T处包被标准抗原，C处包被抗免疫金抗体，测试时待测标本加于A端，若待测标本中含有待测抗原，流经G处时结合金标抗体，当混合物移至T处时，因无足够游离的金标抗体与膜上标准抗原结合，T处无棕红色线条出现，实验结果为阳性，游离金标抗体或金标抗体复合物流经C处，与该处的抗金标抗体结合出现棕红色的质控带，若标本中不含待测抗原，金标抗体则与T处膜上的标准抗原结合，在T处出现棕红色的线条，实验结果为阴性。
　　　　　　　　　　　　　
　　图-3免疫层析试验竞争法测小分子抗原原理图
　　3）间接法测抗体：
为了消除待测血清标本中大量的非特异性IgG与特异性IgG竞争结合金标记抗人IgG，降低了试验敏感性，胶体金间接免疫层析法测抗体常设计成反流免疫层析法(图-4)。
　　　　　　　　　　　
　　　图-4免疫层析试验测抗体原理图
　　测试卡分成可左右折叠的两部分，右面中央纵向贴有NC膜条为膜上包被有抗原线T，E处为与蛋白结合的有色染料，F处吸水材料；左面中央开有观察窗口 B，C处固定有金标记羊抗人抗体，A、D处为吸水材料。测定时先将缓冲液加在D处层析至C处使金标物复溶，然后将标本加在E处使其与染料一起在膜的层析作用下向F端移动，若标本中有待测抗体存在，则与膜上抗原结合形成抗原抗体复合物，待有色染料延伸至膜上标记线G处时，在F处加缓冲液，合上测试卡，A的强大吸水作用使膜上液体反向流动，标本中非特异性IgG及无关物被洗回E处，随后而来的金标羊抗人抗体与抗原抗体复合物结合，出现棕红色线条。无棕红色线条出现则表明血清中无特异性抗体。该法有效地排除了非特异性抗体对测试的干扰。
　　3．实验材料
临床上有现成试剂盒供应，试剂盒主要成分为胶体金层析条，所用试剂全部为干试剂，它们被组合在一试剂条上(如图15-2)，试剂条的底板为单面胶塑料片, 层析条为多孔聚乙烯、硝酸纤维素、玻璃纤维素材料，A、B两端粘贴吸水性强的滤纸等材料。G为干燥固定在玻璃纤维膜等材料上的胶体金结合物。T为粘附有已知的抗体或抗原，C处粘附有质控品(抗免疫金抗体)，T、C点物质往往以直线的形式包被在膜上。
　　4．技术要点
　　实验操作非常简单 其操作要点为：
　　1）将试剂条标记线一端浸入待测标本中2-5秒或在标本加样处加一定量待检标本，平放于水平桌面上。
　　2）5-20分钟内观察结果。
　　3）结果判断：阴性：出现一条棕红线质控条带，阳性：出现两条棕红线条带，试剂失效：无棕红线条带出现。